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干細(xì)胞治療所用到的無血清培養(yǎng)基（lonza 12-725F)（點擊進入）
臨床需求 肝臟疾病已成為越來越重的負(fù)擔(dān)，僅在英國，去年一年由其導(dǎo)致的死亡人數(shù)已達(dá)10000。肝功能不全指急性或慢性肝病導(dǎo)致肝臟正常生理功能的改變，肝細(xì)胞不能有效增生而出現(xiàn)功能障礙。未經(jīng)治療的肝功能不全最終危害患者生命，目前核心的有效治療在于全肝移植。 隨著肝病負(fù)擔(dān)的加重，越來越多的患者需行肝移植治療，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過適合的肝臟供給數(shù)目，許多不能進行肝移植治療的患者過早走向了生命盡頭。來自英國國王學(xué)院的Tamir Rashid等就細(xì)胞治療肝病的進展進行綜述，并發(fā)表在2014年9月2日的Gut雜志上。 肝臟由多種細(xì)胞構(gòu)成，如內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、Kuppfer細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等，它們共同構(gòu)成了肝臟主要細(xì)胞——肝細(xì)胞周圍的支持結(jié)構(gòu)，用肝細(xì)胞治療肝病從理論上來說似乎是肝移植的有效替代方案。 在小動物身上的多種肝病模型顯示，肝內(nèi)肝細(xì)胞移植是有效的，然而人體試驗卻不太令人滿意，最好的研究結(jié)果（也可能是僅出現(xiàn)的）出現(xiàn)在代謝性肝病的患兒身上。這點提示，這些間質(zhì)細(xì)胞在肝細(xì)胞移植中也有著十分重要的作用。 然而構(gòu)建肝臟間質(zhì)細(xì)胞的工作十分繁瑣，臨床上更加可行的一種方案或許是肝外肝細(xì)胞移植（E-HTx），在肝功能不全患者等待移植過程中或自身修復(fù)功能恢復(fù)時起過渡作用。初步的臨床研究表明，將藻酸鹽顆粒包裹的肝細(xì)胞運送至急性肝衰竭的患兒腹膜周圍有一定作用。 這些研究都很振奮人心，但仍需進一步確認(rèn)。擴展這一技術(shù)應(yīng)用的重點在于弄清楚E-HTx有效是因為移植的細(xì)胞是作為獨立的肝外器官起作用，還是間接（移植的細(xì)胞通過分泌某些因子從而增強自身肝細(xì)胞的增生功能）起作用，探明這點才能更加準(zhǔn)確評估獲益更大的患者。 許多肝病專家認(rèn)為，肝內(nèi)與肝外肝細(xì)胞移植均存在潛力，但受肝細(xì)胞供體不足的限制。增加肝細(xì)胞來源途徑，如從干細(xì)胞中獲取肝細(xì)胞等方式將有助于解決此問題。但關(guān)鍵問題在于：怎樣獲得這些細(xì)胞及如何知道所得細(xì)胞就是肝細(xì)胞？ 盡管干細(xì)胞被認(rèn)為存在于任何組織中，但其在成人肝組織內(nèi)的存在與否卻備受爭議。至今為止，還沒有人能從肝臟干細(xì)胞中分離出能獨立增殖、發(fā)揮臨床作用的干細(xì)胞。 另一方面，胚胎干細(xì)胞（ESCs）的存在毋庸置疑，它們來源于胚胎的內(nèi)細(xì)胞團，能再次種植并最終執(zhí)行特定功能。ESCs具有多能性，也就是說，它們分化能力很強，并且能分化成人體內(nèi)的任何一種細(xì)胞類型，這與組織中的肝細(xì)胞不同，因為后者的分化及分裂能力都存在一定限制。 然而ESCs的獲得受其來源及倫理限制，因而在臨床中應(yīng)用不廣。2006年，一個令人興奮的發(fā)現(xiàn)指出了可能取代ESCs作用的方法。日本的一位干細(xì)胞生物學(xué)家Shinya Yamanka發(fā)現(xiàn)了另一種多能干細(xì)胞，它并不來源于ESCs，而來源于成人細(xì)胞，并將其稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。 這種細(xì)胞可以從成人身上的任何一種細(xì)胞中獲得，但通常從皮膚成纖維細(xì)胞中獲得，因其獲取方式容易。制取iPSC的方法簡單，需要幾個重要轉(zhuǎn)錄因子的短暫過度表達(dá)，通過重新編碼、表觀修飾，首發(fā)細(xì)胞回到胚胎干細(xì)胞狀態(tài)。 由于該細(xì)胞增生能力極強，如果能發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)iPSCs轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞的合適制劑，將有源源不斷的肝細(xì)胞產(chǎn)生。該方案除了能解決肝細(xì)胞來源問題，也有助于解除患者免疫抑制劑使用需要。重新編碼能使細(xì)胞恢復(fù)再生能力這一理論已在多個實驗室中得到證實，為其在臨床應(yīng)用中的可行性進一步提供了依據(jù)。 干細(xì)胞——經(jīng)重新編碼并轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞（R-HEPS） 將供體細(xì)胞重新編碼轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞現(xiàn)在已十分容易實現(xiàn)，然而，使其轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞卻極具挑戰(zhàn)。許多研究團隊正在使用體外培養(yǎng)二維細(xì)胞方法的基礎(chǔ)上，不斷嘗試和重復(fù)，以期發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞的方法。 緊隨而來的是另一波學(xué)者，他們報道了一種使干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞或內(nèi)胚層細(xì)胞更直接的方法，后者速度更快，但仍需更多研究重復(fù)。有趣的是，有報道稱，第二種方式所產(chǎn)生的細(xì)胞的某些表型特征優(yōu)于第一種方式。 肝細(xì)胞質(zhì)量 假設(shè)通過重新編碼技術(shù)來獲得肝細(xì)胞前景樂觀，我們可以想象不久后將有數(shù)以億計的肝細(xì)胞運用于臨床，迎接我們的下一個挑戰(zhàn)是設(shè)定質(zhì)量控制措施，即如何知道從生產(chǎn)線上獲得的細(xì)胞就是我們需要的。 盡管原代肝細(xì)胞的幾個重要特征在重新編碼獲得的肝細(xì)胞（r-Heps）中都具備，仍然有對其成熟度和安全性的顧慮。研究人員似乎同意r-Heps在某些方面仍不成熟——本質(zhì)是相符的，但是可能在完全分化成熟方面遇到障礙，因此需要進一步研究。 許多科學(xué)家現(xiàn)在集中精力嘗試體外生產(chǎn)成熟肝細(xì)胞，并小有成就。目前公認(rèn)的推斷一種細(xì)胞是否成熟主要基于兩點：體外藥物代謝和體內(nèi)觀察鼠類肝損傷模型的修復(fù)能力。原代肝細(xì)胞是采用50多年前發(fā)明的一項技術(shù)從人肝臟組織中提取出來的。 此外，更重要的是弄清楚哪種肝細(xì)胞會在某種特定的肝病中其治療作用。因此，我們需要擴大動物試驗的規(guī)模或者大力推進人體試驗。雖然繼續(xù)研究和改進細(xì)胞生產(chǎn)將為人類帶來益處，但Tamir等建議是時候檢測已獲得細(xì)胞在人體內(nèi)的有效性。然而，我們必須時刻謹(jǐn)記，這些細(xì)胞的遺傳及表觀遺傳穩(wěn)定性尚未明確。 因此，在人體內(nèi)使用重新編碼細(xì)胞十分危險，因為他們在體內(nèi)的分布并不能控制。因此，Tamir等建議發(fā)明一種可移動的載體將細(xì)胞裝載，避免其在體內(nèi)播散或形成腫瘤。這也讓我們考慮，此結(jié)構(gòu)的多維、多細(xì)胞構(gòu)成是否會影響其功能發(fā)揮，以及下一代的肝細(xì)胞療法是否也會遇見類似的問題。 多維肝細(xì)胞 正如上面所討論的，現(xiàn)行的關(guān)于肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方案聚焦在單細(xì)胞的分化，很有可能產(chǎn)生多種細(xì)胞，使其功能不能發(fā)揮極致。我們忽略的一個重要事件是細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)，該過程在時空上對器官發(fā)育進行調(diào)節(jié)。 空間的調(diào)節(jié)在三維狀態(tài)下發(fā)生，與支撐結(jié)構(gòu)如間質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞的相互作用有關(guān)。細(xì)胞間相互作用精確的時間調(diào)控在三維調(diào)控的基礎(chǔ)上更添難度。這些都顯示肝臟自然生成的過程中需要四維、多細(xì)胞的調(diào)控。目前的干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)尚難以達(dá)到四維調(diào)控的目的。 為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，科學(xué)家們又研發(fā)出一項新技術(shù)，通過對早期器官形成的細(xì)胞間的相互作用進行調(diào)控而培育出“器官芽”。特異的由iPSC獲得的肝細(xì)胞與間質(zhì)祖細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)，可以縮合形成三維的類器官結(jié)構(gòu)。多種祖細(xì)胞產(chǎn)生的作用對其進行四維調(diào)控，從而形成了肝芽樣結(jié)構(gòu)（微型肝）。 令人興奮的是，將肝芽樣結(jié)構(gòu)移植入體內(nèi)，血管生成將刺激肝細(xì)胞成熟，此過程無需其他環(huán)境誘因（如嚴(yán)重肝臟損傷）。成熟的肝臟結(jié)構(gòu)能顯著改善化學(xué)藥物誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠的預(yù)后。通過iPSC獲得的肝芽似乎能夠作為肝外來源的肝臟支持系統(tǒng)提供潛在的治療作用。 盡管仍存在不明問題，如起治療作用的直接或間接原因。但該技術(shù)最終有望治療肝功能不全。同時，它也為一個假說奠定了基礎(chǔ)，即為了獲得最有效的治療結(jié)果，重要細(xì)胞之間復(fù)雜的生物學(xué)相互作用可能需要重建。
肝細(xì)胞——一個完整器官 盡管單細(xì)胞、多細(xì)胞、芽細(xì)胞等治療方案將對數(shù)目眾多的肝病患者產(chǎn)生重大影響，但它大多數(shù)情況下無法治療需要全肝移植的患者。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，我們必須明白干細(xì)胞生物學(xué)的“圣杯”——在實驗室中合成一個全新的器官。 近期一些研究表明，實驗室中使用工程支架“播種”干細(xì)胞而獲得產(chǎn)物能帶來較好的經(jīng)濟效益，但以相同的規(guī)模及根據(jù)人類的復(fù)雜度重復(fù)該過程目前仍困難重重，即便是前面提到的體外獲得有功能的肝細(xì)胞也不是一項能輕而易舉就完成的挑戰(zhàn)。 比較折中的是采用雜交途徑，即使用大型動物作為活的載體支架，使通過iPSC獲得的肝細(xì)胞完成轉(zhuǎn)換，因為大型動物肝臟及胰腺等器官的生理機制與人類相似。為了達(dá)到這一目的，我們必須設(shè)法將iPSCs/肝芽種植到適合的動物宿主，并使其停留足夠長的時間以使四維器官生成。 沿著這條路徑，近來有研究報道，由基因工程造成的器官缺陷動物，在其植入前胚胎階段，補償性地提供供體干細(xì)胞，能產(chǎn)生有功能的胰腺，該結(jié)論已在鼠類和豬體內(nèi)得到證實。有一點仍不明確，即從高等動物如靈長類及人類身上獲得的供體細(xì)胞是否也能同樣完成組織重建。 如果上述跨種族的雜交能夠成功，我們將有望從豬和羊身上獲得成千上萬的人類肝臟。確實，如果上述方案可行，我們可以把那些動物稱為“器官生物反應(yīng)器”，因其解決了我們供體器官短缺的問題。 可能就目前來說，該想法超越了科學(xué)現(xiàn)實，但是盡管其不能即刻獲得可以使用的終產(chǎn)物，這項技術(shù)無疑證實了在實驗室中獲得有功能的干細(xì)胞源性治療方案是有效的。 文獻原文：Novel strategies for liver therapy using stem cells.
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