| ? | ||||||||||||
|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.pyjb.com.cn |
免責(zé)聲明：本文內(nèi)容來(lái)自互聯(lián)網(wǎng)，如有不慎侵害的您的權(quán)益，請(qǐng)告知我們，將盡快刪除。 慢病毒 利用病毒傳遞系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在基因和蛋白質(zhì)研究已變得很常見(jiàn)，慢病毒載體就可以穩(wěn)定地表達(dá)目的基因。 慢病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，它的主要作用機(jī)制是表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶，將病毒RNA轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，整合酶再將病毒DNA插入宿主DNA，然后和宿主細(xì)胞一起進(jìn)行分裂。 慢病毒可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，如有絲分裂后的細(xì)胞。
概述
我們都知道，病毒缺乏復(fù)制機(jī)制，所以需要細(xì)胞來(lái)“存活”。慢病毒載體傳遞系統(tǒng)最重要的一個(gè)方面就是慢病毒載體的生產(chǎn)，通常在HEK293細(xì)胞(或一些變種)。 例如，慢病毒傳遞系統(tǒng)的一個(gè)常見(jiàn)用途是插入短的發(fā)夾RNAs (shRNA)，用于RNAi介導(dǎo)的基因敲除。 shRNA首先被包裝成慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育約3天，此間慢病毒復(fù)制和產(chǎn)生慢病毒顆粒，然后收獲，評(píng)價(jià)滴度，再轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞。 關(guān)于轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞 維持細(xì)胞的良好狀態(tài)是必要的。HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，胰蛋白酶化速度快，所以不要在胰蛋白酶中長(zhǎng)時(shí)間孵育，否則可能會(huì)有大量細(xì)胞死亡。 解凍后的細(xì)胞應(yīng)至少傳代兩次，然后接種進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。并且要非常輕柔地處理，因?yàn)榧?xì)胞很容易分離。 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，HEK293細(xì)胞接種于約5*10^6細(xì)胞/10cm培養(yǎng)皿中，接種后次日細(xì)胞約40-50%融合。 為轉(zhuǎn)導(dǎo)做好準(zhǔn)備 將慢病毒載體質(zhì)粒連同病毒包裝載體打包成脂質(zhì)體，并將其遞送到HEK293細(xì)胞中。 在實(shí)驗(yàn)的包裝部分使用無(wú)血清培養(yǎng)基是非常重要的。無(wú)血清培養(yǎng)基促進(jìn)DNA與陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的形成，提高轉(zhuǎn)染效率。 有了轉(zhuǎn)染復(fù)合物，含shRNA、包裝質(zhì)粒和脂質(zhì)體，就可以進(jìn)行包裝了。傾斜帶有HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)皿，將轉(zhuǎn)染混合物逐漸加入收集的培養(yǎng)基中。 在添加轉(zhuǎn)染混合物時(shí)要謹(jǐn)慎，溫柔操作。一旦加入溶液，小心地旋轉(zhuǎn)平板，使培養(yǎng)基混合，將轉(zhuǎn)染混合物均勻地分配到細(xì)胞上。在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-8小時(shí)。 孵育后，輕輕抽吸培養(yǎng)基(這將包含沒(méi)有轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的含有質(zhì)粒的脂質(zhì)體)，并在培養(yǎng)皿的一側(cè)加入10 ml完全培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞就不會(huì)分離。HEK293細(xì)胞將shRNA包裹成病毒顆粒并釋放到培養(yǎng)基中。 此時(shí)，培養(yǎng)基中會(huì)充滿(mǎn)病毒顆粒，因此在搬運(yùn)時(shí)應(yīng)穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)用品。 48小時(shí)后收集培養(yǎng)基(病毒顆粒)，將10 ml新鮮的完全培養(yǎng)基加入同一培養(yǎng)皿中。72小時(shí)后再次收集培養(yǎng)基，與48小時(shí)收集的結(jié)合。 通過(guò)0.45微米的過(guò)濾器對(duì)收集到的混合培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，以允許病毒通過(guò)。凍融循環(huán)會(huì)降低病毒的效力，所以最好進(jìn)行分裝。 病毒可以在4℃下保存一到兩個(gè)月，長(zhǎng)期保存在-20℃。經(jīng)常使用漂白劑處理在病毒產(chǎn)生過(guò)程中使用的吸管頭和平板。 病毒進(jìn)入細(xì)胞 通常，測(cè)定病毒的效價(jià)非常重要，方便確定實(shí)驗(yàn)濃度。一個(gè)良好的敲除，至少50%的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒。用適當(dāng)?shù)姆治龇椒z查細(xì)胞是否定點(diǎn)敲除，通常涉及到Western Blot。 1.使用相同比例的病毒和細(xì)胞獲得50%的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)15ml的試管中，用5ml的完全培養(yǎng)基重懸約200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞（10cm培養(yǎng)皿的四分之一）。 在同一試管中，加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通過(guò)中和病毒顆粒和細(xì)胞膜之間的電荷來(lái)提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 2.輕輕混勻，將細(xì)胞放入一個(gè)10cm的新培養(yǎng)皿中。24小時(shí)后，換到?jīng)]有病毒的新鮮完全培養(yǎng)基中。 如果shRNA構(gòu)建物含有熒光標(biāo)記物，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)是否整合成功；如果沒(méi)有，繼續(xù)進(jìn)行抗生素選擇48小時(shí)。
|
購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
m.pyjb.com.cn |
|
