| ? | ||||||||||||
|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.pyjb.com.cn |
鱟試劑是從棲生于海洋的節肢動物“鱟”的蘭色血液中提取變形細胞溶解物，經低溫冷凍干燥而成的生物試劑，專用于細菌內毒素檢測。 鱟試驗法是國際上至今為止檢測內毒素最好的方法，它簡單﹑快速﹑靈敏﹑準確，因而被歐美藥典及我國藥典定為法定內毒素檢查法，并已被世界各國所采用。
目前國際上銷售的鱟試劑有兩種，一種稱美洲鱟試劑（Limulus Amebocyte Lysate），縮寫為LAL，由美國生產；另一種稱東方鱟鱟試劑（Tachypleus Amebocyte Lysate），縮寫為TAL。實驗證明：美洲鱟試劑-LAL比東方鱟試劑LAL更純潔，檢測效果更好。
TAL檢查內毒素有很多方法，目前應用最廣泛的是凝膠法，此外還有動態濁度法﹑顯色基質法,比色法等。其用途有以下幾方面：1. 藥檢：用于注射藥品﹑放射性藥物﹑生物制品﹑注射器及生產工藝流程中的內毒素檢測；2. 臨床：用于檢測病人各種體液中的內毒素含量；3. 其他：用于檢測水或食品中的內毒素含量。
2005年版中國藥典 《細菌內毒素檢查法-鱟試劑法》(鱟試劑－LAL法)
本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。
細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為準。
細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示。
細菌內毒素國家標準品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。
細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及設置的各種陽性對照。
凝膠法細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測定用的細菌內毒素檢查用水，其內毒素的含量應小于0.005EU/ml。
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。
供試品溶液的制備 某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適宜的緩沖劑調節PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已去除內毒素的容器中進行配制。緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。
內毒素限值的建立 藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；
K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。
M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均體重按60kg計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。
按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。
確定最大有效稀釋倍數（MVD） 最大有效稀釋倍數是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數，在不超過此稀釋倍數下可進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD：
MVD=CL/λ
式中L為供試品的細菌內毒素限值；
C為供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml，當L以EU/mg或EU/U表示時，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計算供試品的最小有效濃度C=λ/L。
λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
方法1 凝膠法
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。
鱟試劑靈敏度復核試驗 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。
根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取含有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復溶后的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，及每一個濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°時，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。
若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc).
λc=1g-1(∑X/4)
式中X為反應終點濃度的對數值（1g）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。
當λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。
干擾試驗 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下式計算C和B的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)
Et= 1g-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數值（1g）。
當Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。
表1 凝膠法干擾試驗溶液的制備
注：A 供試品溶液；B干擾試驗系列；C鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D陰性對照。
可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。
當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。
當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
檢查法
1）凝膠限量試驗
按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數為MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
表2 凝膠限量試驗溶液的制備
注：A供試品溶液；B供試品陽性對照；C陽性對照；D陰性對照。
結果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。
若溶液A的兩個平行管都為陰性，判供試品符合規定；若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性另一管為陰性，需進行復試。復試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規定；否則判供試品不符合規定。
2）凝膠半定量試驗
本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟度劑靈敏度復核試驗項下操作。
結果判斷 若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，試驗有效。
系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果試驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數。
如試驗中供試品溶液的結果都為陰性，應記為內毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數）。如果結果都為陽性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。
若內毒素濃度小于規定的限值，判供試品符合規定。若內毒素濃度大于或等于規定的限值，判供試品不符合規定。
表3 凝膠半定量試驗溶液的制備
注：A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。用檢查用水進行2倍系列稀釋，從通過干擾試驗的稀釋倍數開始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過MVD；
B：含2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）；
C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度標準內毒素的檢查用水系列；
D：陰性對照。
方法2 光度測定法
光度測定法分為濁度法和顯色基質法。
濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反映混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關系來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的有色團的量之間存在著量化關系來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的色度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測色度增長速度的方法。
光度測定試驗應在特定的儀器中進行，溫度一般為37℃±1℃。
供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。
為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品溶液的干擾試驗。
標準曲線的可靠性試驗 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。
用標準內毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照。當陰性對照在設定的時間內不發生反應，將全部數據進行線性回歸分析。
根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數（r）的絕對值應該大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。
干擾試驗 選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個平行管。
表4 光度測定法干擾試驗的制備
注 A：稀釋倍數未超過MVD的供試品溶液。
B：加入標準曲線中點或靠近中點的一個已知內毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數的供試品溶液。
C：如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內毒素溶液。
D：陰性對照。
按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×100%
當內毒素的回收率在50%~200%之間，則認為在此該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。
當內毒素的回收率不在指定的范圍時，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素。并要重復干擾試驗來驗證處理的有效性。
當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
檢查法
按“光度法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。
使用溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一平行管的內毒素濃度。
試驗必須符合以下三個條件方為有效：
（1）系列溶液C的結果要符合 “標準曲線的可靠性試驗”中的要求。
（2）用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50%-200%的范圍內。
（3）溶液D在規定的時間內不發生反應。
若供試品溶液所在平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數和濃度后，小于規定的內毒素限值，判供試品符合規定。若大于規定的內毒素限值，判供試品不符合規定。
（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。）
美國藥典USP24版細菌內毒素檢查法(鱟試劑－LAL法)
本文是USP24細菌內毒素檢查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的譯文，但目前執行的標準是USP24版第二增補本（USP—NF19 Second Supplement）的細菌內毒素檢查法，讀者可對照學習，從中可看出USP24細菌內毒素檢查的不足之處。本文將介紹用鱟試劑檢測樣品內或樣品上存在的細菌內毒素濃度的方法。鱟試劑（Limulus Amebocyte,LAL）來自鱟的循環細胞，經水提取而行，制備和檢驗后，用于凝固法。
反應的終點是將供檢樣品稀釋后，與平行稀釋的參考內毒素標準進行直接比較得到的。測得的內毒素含量用規定的內毒素單位表示。
鱟試劑也是用濁度法或顯色法來讀取數據的，這些試齊只要能滿足這些選擇方法的要求，就可以使用。在做試驗時，需要先做出一條標準曲線，并用該曲線計算供檢樣品的內毒素含量，包括樣品和對照液加鱟試劑后的培育時間和在分光光度計上讀取光密度時使用的波長等操作，都應該事先規定好。如果是終點濁度法，則到達培育期后，應立刻讀取讀數。而動力學檢測（兇手濁度法和顯色法），光密度的測定是貫穿于整個反應期間，而用于計算結果的百分數就是從這些讀數中計算出來的。在用終點法的顯色法檢測時，在到達事先規定的反應時間后，添加停止酶反應的試劑使反應停止后，再讀取數據。
1、參考內毒素標準與對照內毒素標準
參考內毒素標準（Reference standard endotoxin,RSE）是美國藥典（USP）的內毒素參考標準，其效價為每瓶10 000個USP內毒素單位（EU）。每瓶參考內毒素標準加5ml鱟試劑用水（LAL Reagent Watet），用旋轉攪拌器間歇攪拌30min使其溶解，制成原液，用這一原液制作合適的系列稀釋。原液應保存于冰箱中，用于以后的稀釋，但保存時間不得超過14d。用前，用旋轉攪拌器強力攪拌至少3min，每一步稀釋，至少攪拌30s，然后才能用它稀釋下一步。經稀釋的參考內毒素不得貯存待以后使用，因為吸附作用會使其失去活性。對照內毒素標準（Contuol standard endotoxin,CSE）是以參考內毒素標準為標準另行制備的。一批新的對照內毒素標準在使用前應進行檢定。檢定時使用的鱟試劑應為試驗中使用的同批鱟試劑。參考內毒素標準對照內毒素標準進行檢定時，可使用鱟試劑的凝固法，按“試驗操作”進行。每批對照內毒素標準，至少取1瓶與1瓶參考內毒素標準進行對比。參考內毒素標準的每個稀釋度作4管。每瓶或每個樣品的對照內毒素標準的每個稀釋度也都要4管。參考內毒素標準終點的對數Log10的平均值和對照內毒素標準終點的對數Log10平均值之間的差值的反對數等于對照內毒素標準效價的標定值。可根據情況，將其變換成每ng干燥制劑的單位數或每瓶所含的單位數。
適宜的對照內毒素標準的效價應不小于2EU/ng也不大于50EU/ng。
2、試驗的準備
鱟試劑的靈敏度應經過確證。試驗中使用的所有容器和用具，都必須在≥250℃的烤箱中，用足夠的時間進行加熱處理、破壞這些用具表面上可能存在的外源性內毒素。
內毒素試驗的結果是否可靠，還必須從試驗使用的各種用具、溶液、洗滌用品中取樣或提取樣品，并用適當的方法證明它們對反應沒有抑制或拉強或其它干擾作用。可按下述方法進行抑制試驗或增強試驗。試驗中應設置陰性對照。如果鱟試劑的原材料、生產方法或處方發生改變時都要重新進行試驗。
3、鱟試劑靈敏度的確認試驗
為了確認鱟試劑標簽上的靈敏度，每批至少取1瓶樣品進行檢定。參考內毒素標準（或對照內毒素標準）作2倍系列稀釋，稀釋成2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。其中λ是鱟試劑標簽上的靈敏度EU/ml。
上述4個稀釋度和陰性對照都要重復做4管。所得結果的幾何平均值的對數應大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ。每一批新的鱟試劑，使用前都必須作標簽靈敏度的確認試驗。
4、抑制試驗和增強試驗
用不超過地大有效稀釋而檢測不出內毒素的樣品，不加或內毒素，使最后濃度等于2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。按照試驗操作（Test Procedure）項的規定用標準內毒素進行檢定。不加和加內毒素的樣品管至少做4管。同時，用水稀釋上述相同濃度的內毒素和陰性對照各兩管，做平行兩管試驗。按照計算和判定項的方法，計算樣品終點內毒素濃度的幾何平均值。
如果所得結果大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ,則該樣品適合作細菌內毒素檢查。
用中和、滅活或除去干擾物質方法或用不超過最大有效稀釋度稀釋檢品后，可重做抑制試驗和增強試驗。如果用不超過最大有效稀釋法，對已知加量的內毒素可以克服抑制和增強作用。則樣品可以經過稀釋后，再作內毒素檢查。
如果在試驗條件下，對未處理的樣品檢查出有內源性內毒素。則該樣品不適合用于作抑制或拉強試驗。不過，這種樣品可用超過濾法將存在的內毒素去掉或做適當稀釋、使之適合于作抑制或增強試驗。稀釋未處理樣品（像開瓶溶解或在使用前注射前稀釋那樣），稀釋到檢驗不到內毒素但不超過最大有效稀釋倍數。再用這些已稀釋的樣品重作抑制試驗或增強試驗。
5、最大有效稀釋度（MVD）
最大有效稀釋度是指在使用時將藥物溶解或稀釋成恰好用于注射或其它非經口途徑使用的濃度。有時為了避免給藥量的體積（EU/ml）計算。用試劑標簽上的靈敏度（EU/ml）λ除限定濃度，就可以得到MVD因子。如果某一試劑的限量濃度是按重量或按藥品的活性單位計算（EU/mg或EU/單位）。用限量乘藥品在溶液中的濃度，或按標簽說明稀釋成的濃度（mg/ml或單位/ml）,再除的λ，就可以得到MVD因子是準備試驗而使試驗有效的限定稀釋因子。
6、試驗操作
在準備和進行試驗的過程中，必須十分注意，避免使樣品受到大量的細菌污染。為了定量檢測樣品中的內毒素含量，常用系列稀釋法稀釋樣品。用幾何稀釋法，使每上一步稀釋較下一步稀釋成為定比關系。試驗中應設陰性、陽性對照和陽性產品對照。
供試的每一個樣品的每一步系列稀釋，至少要做重復性2管。標準內毒素的系列稀釋應包括至少兩個重復管。每一個框架的試管中都必須有一組標準內毒素的系列稀釋管。只要每一個框架的環境條件是均一的，一個框架中可以由幾個試管架組成。
（1）準備：標準內毒素以及鱟試劑的形狀與裝量，各個廠家不盡相同。因此，溶解和稀釋必須按標簽的說明進行。樣品和鱟試劑混合物的pH，除另有規定外，必須位于6.0—8.0之間。樣品的pH在試驗前，可添加滅菌的無內毒素污染的氫氧化鈉、鹽酸或適宜的緩沖液調整。
（2）操作：取若干10mm×75mm試管或單個的試驗管。每管加適量的陰性對照、標準內毒素、樣品和陽性產品對照。陽性產品對照由鱟試劑、洗液或提取液添加2.0λ濃度的標準內毒素置中，準確記錄試管的放置時間、于37℃±1℃，放置60min±2min,輕輕地取出觀察。形成結實的凝膠，翻轉180°，停留于原處不動者為陽性，記（+）號。不形成凝膠或形成的凝膠不結實，則判為陰性、記（-）號。拿取試管時，要輕拿輕放，避免不必要的碰撞，而出現假陰性結果。如果陽性產品對照呈陰性或內毒素標準的濃度不落在鱟試劑標簽靈敏度2倍稀釋的±1之間，或任何陰性對照出現陽性，試驗應判為無效。然后計算樣品中的內毒素含量。
7、計算和判定
（1）幾何平均值的計算：系列稀釋最后的陽性管為樣品或樣品加內毒素管的終點。記錄每管的終點濃度E，換算成對數終點濃度e，用下列公式計算終點的幾何平均濃度：
終點的幾何平均濃度=log-1(Σe/f)
其中Σe為各稀釋度對數終點之和；f為各稀釋度的重復管安數。
（2）內毒素含量計算：計算被檢樣品中或被檢樣品上的內毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）時，首先計算出終點濃度E，再乘以稀釋因子λ（λ為鱟試劑標簽注明的靈敏度）。被檢樣品的幾何平均濃度等于Σe/f的反對數，其中e等于終點濃度的對數，f為被檢樣品該稀釋度的重復管數。
（3）結果判定：如果內毒素含量小于該品種規定的含量界限，則該品種符合規定。
|
購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
m.pyjb.com.cn |
|
