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人胚胎干細胞的無飼養層培養實驗
（參考冷泉港試驗室protocol）
作者：Sohyun L. McElroy1 and Renee A. Reijo Pera
Center for Human Embryonic Stem Cell Research and Education, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University, Palo Alto, CA 94304-5542, USA
通訊作者郵箱： sohyun@stanford.edu 簡介：
人胚胎肝細胞(hESCs)具有分化成內、中、外三個胚層和經體外長期培養而不斷增殖的潛能。hESCs有著廣闊的應用前景，它能作為“細胞源”用于新型療法的測試、藥物篩選和功能基因應用等領域；通過利用小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)或人來源細胞作為飼養層，可以維持hESCs未分化狀態和增殖能力。以下試驗方案中，我們描述了應用MEF條件培養系統為基質進行hESCs 無飼養層培養方法。此方法由于排除了飼養層細胞帶來的污染問題，適用于hESCs的基因改造（genetic modification）等研究。
實驗材料: 1. 所需試劑（所有溶液均需用0.2-µm過濾器除菌，然后4°C或按特別說明進行保存）：
1) bFGF solution (10 µg/mL)
2) Collagenase solution (1 mg/mL)
3) Freezing medium for primary cells
4) Gelatin solution (0.1%, w/v) for MEF
hESCs (cultured in a six-well plate)
Knockout DMEM (Invitrogen 10829-018) (chilled)
5） KSR medium for hESC
6） Matrigel stock solution
MEF feeder cells (irradiated CF1) as prepared in Preparation of Mouse Fibroblast Feeder Cells for Human Embryonic Stem Cell Culture (McElroy and Reijo Pera 2008a)
7） MEF medium for hESC
8） Phosphate-buffered saline (PBS) (1X) (Ca2+/Mg2+-free)
2. 實驗設備
1) 離心管 (Falcon) 15mL
2） 10cm培養皿 (optional; see Step 1)
3） 過濾器(0.2-µm)
4） 培養箱（37°C, 5% CO2)
5） 液氮罐
6） 顯微鏡
7） 移液管 (5或10-mL) 或細胞刮片
8） 6孔細胞培養板
實驗操作：
A.條件培養基(CM)的配制
1. 用處理過的MEFs（20,000 cells/cm2 in MEF medium）鋪板/培養皿。請參考Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells (McElroy and Reijo Pera 2008b), 37°C 、5% CO2培養箱中培養過夜。
2. 第二天，倒去MEF培養液, 用1X PBS洗板/培養皿兩次；倒去PBS后加入用于hESCs 培養的KSR medium (0.3 mL/cm2).
3. 24小時后，從培養板/皿中收集條件培養基（CM），加入4 ng/mL bFGF后用0.2-µm 過濾裝置過濾除菌。
說明：條件培養基（未加bFGF）可以保存于–20°C備用。
4. 加入新的KSR medium到鋪有MEF飼養層細胞的板/皿中, 可每天收集條件培養基。
說明：鋪有MEF飼養層細胞的板/皿可用于生產條件培養基一周時間。
B．準備Matrigel基質包被板
5. 把Matrigel stock solution 放于4°C冰上緩慢解凍至少2 h ，以避免形成凍膠。
6. 把Matrigel stock solution與冰冷的knockout DMEM 1:15 混合稀釋成工作液. 6孔板每孔加入1 mL Matrigel工作液進行包被.
7. 室溫包被孵育1-2h或4°C包被過夜。
C. hESCs接種基質包被板進行培養
8. 吸去含有hESC克隆的6孔培養板孔中的培養基.
9. 每孔用2 mL 1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗兩次。
10. 每孔加入 1 mL膠原酶溶液，37°C孵育10-15min。
說明：孵育時間長短取決于膠原酶的批次和hESC 細胞系。
11. 在細胞消化期間，用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗滌Matrigel基質包被板兩次，然后每孔加入2mL的條件培養基（步驟3）。
12. 在顯微鏡下檢查hESCs克隆。
說明：hESCs克隆看起來有些皺縮，其邊緣有一定牽扯于板上，而不是完全脫離或漂浮于培養基中。若細胞克隆脫離，收集培養基并離心收獲細胞。
13. 移去膠原酶溶液，并用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗板兩次。
14. 每份（split）細胞加入1 mL條件培養基CM (例如：如果計劃將細胞分成3份，則加入3 mL條件培養基).
說明：建議細胞分割比例為1:1 -1:3,主要取決于ESC克隆細胞濃度。 15. 小心地用移液管 (5或10-mL) 或細胞刮片吧細胞從板孔中刮取下來，轉移孔中內容物到15-mL 離心管中。
16. 通過小心地吹打成小細胞團（約含50-500 cells ）；請注意不要把細胞處理成單細胞懸液。
17. 加入1 mL 包含有細胞的條件培養基到每孔Matrigel包被板孔中。
18. 把培養板放入培養箱中；可以通過在水平和垂直方向上傾斜搖勻數次，使小細胞團分散于培養基中。
19. 每天用2-2.5 mL新的加有4 ng/mL bFGF的條件培養基進行營養補給。
20. 當細胞融合度達到80%，進行傳代培養。
參考文獻：
1.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008a. Preparation of mouse fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5041
2.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008b. Culturing human embryonic stem cells with mouse embryonic fibroblast feeder cells. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5042.
3.Panula, S. and Reijo Pera, R.A. 2008. Preparation of human foreskin fibroblasts for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5043. |
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