ELISA的實(shí)驗(yàn)操作所要求的條件是比較嚴(yán)格的，無(wú)論是對(duì)實(shí)驗(yàn)的硬件條件還是對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作人員的技術(shù)要求，都是如此。下面所提到的就是一些在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)所要注意的一些問(wèn)題。
一、ELISA實(shí)驗(yàn)通用規(guī)則
1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過(guò)2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但最好有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。
3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。
9、溫浴時(shí)，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板，防止水分的蒸發(fā)。
10、洗板時(shí)，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘，使清洗更加徹底。沒(méi)有洗板機(jī)時(shí)，倒去液體后，要將酶標(biāo)板在報(bào)紙或毛紙上用力拍干。
11、洗液不夠時(shí)，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長(zhǎng)期保存。
12、底物是光敏感的，要在臨用前現(xiàn)配。
13、檢測(cè)前，要打開(kāi)酶標(biāo)儀，使之穩(wěn)定10分鐘以上。
14、底物有一定的毒性，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸。
15、待檢樣品要澄清，否則會(huì)影響結(jié)果。
16、溫浴時(shí)間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。
17、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
18、對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。
二、下面所提到的是針對(duì)我公司的ELISA產(chǎn)品會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法
1. 加入反應(yīng)終止液后，沒(méi)有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶標(biāo)記物。
解決辦法：請(qǐng)按照操作步驟進(jìn)行。
b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。
解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進(jìn)行操作。
c.原因：室溫太低。
解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請(qǐng)于操作步驟4，適當(dāng)延長(zhǎng)溫育時(shí)間。
d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。
解決辦法： 請(qǐng)用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。
e.原因：試劑盒已過(guò)有效期限。
解決辦法：請(qǐng)更換成仍在有效期限內(nèi)的試劑盒。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。
a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。
解決辦法： 請(qǐng)確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。
b.原因：操作時(shí)間拖太久。
解決辦法：請(qǐng)?jiān)诜椒ㄊ炀毢笤龠M(jìn)行操作。
c.原因：微孔間相互污染。
解決辦法： 加樣品時(shí)，請(qǐng)小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。
d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。
解決辦法：請(qǐng)使用已校正過(guò)的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。
e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。
解決辦法：加樣品或試劑時(shí)，吸頭請(qǐng)勿接觸微孔。
f.原因：洗板過(guò)程發(fā)生問(wèn)題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。
解決辦法：請(qǐng)隨時(shí)監(jiān)控洗板機(jī)洗板過(guò)程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。
3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。
a.原因：室溫太高(>25℃)。
解決辦法： 若無(wú)法降低室內(nèi)溫度，請(qǐng)適當(dāng)縮短步驟4的溫育時(shí)間。
b.原因：底物溶液受到污染。
解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請(qǐng)不要再使用。
c.原因：反應(yīng)時(shí)間超過(guò)太久。
解決辦法：請(qǐng)控制反應(yīng)時(shí)間。
d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。
解決辦法：使用過(guò)的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過(guò)的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無(wú)殘留)
4. 陰性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。
a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。
解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。
b.原因：洗板過(guò)程發(fā)生問(wèn)題(同2-f.)。
解決辦法：請(qǐng)參考2-f.
c.原因：添加樣品或酶標(biāo)記物的量不一致。
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