ELISA的實驗操作所要求的條件是比較嚴格的，無論是對實驗的硬件條件還是對實驗的操作人員的技術要求，都是如此。下面所提到的就是一些在進行ELISA實驗時所要注意的一些問題。
一、ELISA實驗通用規則
1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但最好有專業人員進行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。
3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復到室溫，以使結果更穩定。
4、實驗時，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產生氣泡而使吸取量不準確。
6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。
9、溫浴時，要用不干膠或膠帶紙封好酶標板，防止水分的蒸發。
10、洗板時，每次洗液加入后，應靜置1分鐘，使清洗更加徹底。沒有洗板機時，倒去液體后，要將酶標板在報紙或毛紙上用力拍干。
11、洗液不夠時，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。
12、底物是光敏感的，要在臨用前現配。
13、檢測前，要打開酶標儀，使之穩定10分鐘以上。
14、底物有一定的毒性，終止液對皮膚有腐蝕性，應盡量避免接觸。
15、待檢樣品要澄清，否則會影響結果。
16、溫浴時間應遵守試劑盒規定。
17、應盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數據的準確性。
18、對結果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。
二、下面所提到的是針對我公司的ELISA產品會出現的問題及解決辦法
1. 加入反應終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶標記物。
解決辦法：請按照操作步驟進行。
b.原因：試劑盒內容物未能充分回。
解決辦法：確定試劑盒內容物回溫后再進行操作。
c.原因：室溫太低。
解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當延長溫育時間。
d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。
解決辦法： 請用試劑盒內所提供的清洗液清洗。
e.原因：試劑盒已過有效期限。
解決辦法：請更換成仍在有效期限內的試劑盒。
2. 標準曲線線性不佳，或是平行性不好。
a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。
解決辦法： 請確認溫育位置既不透光也不透風(如抽屜內)。
b.原因：操作時間拖太久。
解決辦法：請在方法熟練后再進行操作。
c.原因：微孔間相互污染。
解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。
d.原因：標準品或酶標記物所加入的量不一致。
解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。
e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。
解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。
f.原因：洗板過程發生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進行下一步驟)。
解決辦法：請隨時監控洗板機洗板過程，洗完后立即進行下一步驟。
3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。
a.原因：室溫太高(>25℃)。
解決辦法： 若無法降低室內溫度，請適當縮短步驟4的溫育時間。
b.原因：底物溶液受到污染。
解決辦法： 若發現底物溶液已呈現淡藍色，請不要再使用。
c.原因：反應時間超過太久。
解決辦法：請控制反應時間。
d.原因：酶標記物污染了盒內其它試劑。
解決辦法：使用過的吸頭應立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標記物與底物溶液)接觸過的容器應立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)
4. 陰性標準品的吸光值低于陽性標準品的吸光值。
a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。
解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。
b.原因：洗板過程發生問題(同2-f.)。
解決辦法：請參考2-f.
c.原因：添加樣品或酶標記物的量不一致。
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