中華微生物學和免疫學雜志 2000年第5期第20卷 細菌學
作者：芮勇宇 俞守義 王紅 蔡初的 蕭斌權 李建基 廖育煌 鐘豪杰 羅不凡
單位：芮勇宇 俞守義 王紅（510515廣州，第一軍醫(yī)大學流行病學教研室）；蔡初的 蕭斌權 李建基 廖育煌 鐘豪杰 羅不凡（廣州市衛(wèi)生防疫站）
建立PCR-RFLP-SSCP及測序方法，用于分析霍亂弧菌腸毒素AB(ctx-AB)基因多態(tài)性。針對ctx-AB基因設計引物，擴增片段為528bp，包括ctx-B編碼基因375bp，引物序列為5′-GGT GTA AAA TTC CTT GAC G-3′和5′-GGT TCG ATG ATG AGA AGC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ酶切為317bp和211bp 2個片段。對酶切產(chǎn)物進行單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析，銀染色法顯示結果。對不同SSCP類型測序，利用PCR方法直接對PCR產(chǎn)物測序。
霍亂弧菌O1群古典型(CVC)標準株569B和16017，埃爾托型(EVC)標準株919，O139群標準株MO45，EVC80株(廣東省90年代病人分離株)，O139群10株(廣東省90年代病人分離株)，由廣東省和廣州市衛(wèi)生防疫站提供。PCR擴增ctx-AB基因，上述菌株均產(chǎn)生1條約528bp的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ內切酶消化后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，均可見1條約317bp的片段和1條約211bp的片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，分為A和B兩個類型，CVC、EVC和O139群標準株均為A型，80株EVC(廣東省分離株)中8株為A型，其余為B型；O139群(廣東省分離株)均為A型。進一步測序表明兩類型基因序列有3個位點不同，以ctx-B基因的起始堿基定位為1，其下游序列為正，上游序列為負，兩類型在103、115和203位點堿基不同，A型為A、C和C(相應位點編碼的氨基酸為Asp、Tyr和Ile)，B型為G、T和T(相應位點編碼的氨基酸為Asn、His和Thr)。與基因庫中霍亂弧菌的ctx-AB基因序列比較，B型103位點與國外報道的序列均不同，可能為廣東地區(qū)菌株特有的突變。PCR-RFLP-SSCP及測序方法快速、簡便、準確、經(jīng)濟，適用于對大量標本某重要基因多態(tài)性的研究。
(收稿日期：1999-11-17) |
