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【摘要】  目的 構建常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征（AREP）PINK1基因真核表達載體，建立穩(wěn)定表達PINK1蛋白的人神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞株。方法 采用聚合酶鏈反應（PCR）方法，以人胎腦cDNA文庫為模板擴增PINK1基因全長cDNA編碼區(qū)序列，重組DNA技術定向插入真核表達質粒pcDNA3.1-myc-his(-)B，經酶切和測序鑒定后，用脂質體轉染SH-SY5Y細胞，通過G418篩選，挑選出穩(wěn)定轉染的單克隆株，經提取gDNA進行PCR擴增、反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blot 法檢測PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表達。結果 成功構建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表達載體，穩(wěn)定轉染SH-SY5Y細胞后，經提取gDNA擴增、RT-PCR及Western blot檢測到了野生型PINK1基因在基因組的整合、轉錄和蛋白水平表達。結論 構建了PINK1基因真核表達載體和穩(wěn)定表達PINK1蛋白的SH-SY5Y細胞株，為進一步研究PINK1基因功能及AREP發(fā)病機制提供了一個轉基因細胞模型。

【關鍵詞】  常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征；PINK1；穩(wěn)定轉染；SH-SY5Y細胞

　　Establishment of stable expression of wild-type PINK1 protein SH-SY5Y cell line

　　YUAN Xiang-li，ZHANG Yu-hu，LIAO Shu-sheng，et al

　　1.Department of Neurology，Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410008，China

    Abstract:  Objective  To construct the eukaryotic expression vector of autosomal recessive early-onset parkinsonism (AREP) wild type PINK1 gene and to establish human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) stably-expressing PINK1 protein.Methods  The full length PINK1 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and eukaryotic expression vector pcDNA3.1-myc-his-(-)B was inserted.After the identification by digestion and sequencing analysis,the recombinant vector was transfected into SH-SY5Y cell,and the positive mono-clone was screened by G418.The conforming of PINK1 in DNA level was identified by PCR,PINK1 mRNA transcription was detected by RT-PCR，PINK1 protein expression was assessment by western blotting in the positive mono-clones.Results  PINK1-pcDNA3.1-myc-his(-)B eukaryotic expression vector was constructed successfully,and the stable expression of wild-type PINK1-transfected SH-SY5Y cell line was established successfully.Conclusion  The construction of stable expression of wild-type SH-SY5Y cell line can provide a basis for further research on the function of PINK1 and pathogenesis of AREP.

    Key words:  autosomal recessive early-onset parkinsonism;PINK1;stable transfection;SH-SY5Y cell
   
    帕金森病是一種常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，大部分呈散發(fā)性，致病原因不明，近幾年臨床和分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)了呈單基因遺傳方式的家族性帕金森病，至少已有7個致病基因被克隆，其中常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征（autosomal recessive early-onset parkinsonism,AREP）有3種基因型（PARK2、PARK6和PARK7），致病基因分別是PARKIN、DJ-1和PINK1基因［1-3］。PINK1基因突變是AREP的常見原因，僅次于PARKIN［4-5］，PINK1蛋白定位于線粒體上，由581個氨基酸組成，有1個34個氨基酸組成的線粒體定位結域（mitochondrial targeting motif,MTM）和1個高度保守的蛋白激酶結構域（156～509位氨基酸），PINK1基因的功能目前仍不清楚。本研究旨在建立穩(wěn)定表達野生型PINK1蛋白的SH-SY5Y細胞株，為進一步研究PINK1基因的功能和AREP的發(fā)病機制奠定基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 

　　脂質體轉染試劑盒Lipofectamine TM2000和pcDNA3.1-myc-his(-)B購自Invitrogen公司；pcDNA3.1-myc-his(-)B質粒載體購自Invitrogen公司；各種內切酶購自New England BioLab公司；質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；引物合成由上海博亞生物技術有限公司完成；基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；反轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒購Promega公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自PAA公司；OMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；G418購自 Amresco公司；SH-SY5Y由中國科學院生物物理研究所腦與認知國家重點實驗室保存；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自PIERCE公司；His標簽抗體購自Santa Cruzu公司；羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；超敏發(fā)光液購自PIERCE公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  重組真核表達載體的構建

　　根據(jù)PINK1基因CDS序列設計2條外引物（Pfw-Ⅰ和Prv-Ⅱ），用來做初級PCR，在外引物兩側設計2條內引物（PINK1-1-up和PINK1-2-dn）用來做次級PCR。在正向引物PINK1-1-up加上1個EcoR Ⅰ酶切位點（GAATTC），并加上包含Kozak共有序列的起始密碼子（ACCATGG）以增強翻譯起始功能；反向引物PINK1-2-dn加上1個Bam H Ⅰ酶切位點（GGATCC），使得次級聚合酶鏈反應（PCR）產物克隆入真核表達載體pcDNA3.1-myc-his(-)B后，融合載體上的myc-his，并使其讀框不變。以EcoR Ⅰ和Bam H Ⅰ雙酶切鑒定，采用通用引物進行3個反應的雙向測序鑒定。

　　1.2.2  SH-SY5Y細胞轉染 

　　轉染前1 d將SH-SY5Y接種于6孔板，待細胞生長至60%～70%融合時進行轉染，步驟如下：5 μg不同質粒（空載體、野生型）+250 μL OMEM培養(yǎng)基混勻為A液，12 μL Lipofectamine TM 2000+250 μL OMEM培養(yǎng)基混勻為B液，室溫15 min，將A液與B液輕微混勻為C液，室溫30 min；將6孔板培養(yǎng)基吸出，無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗2遍,將無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基加入C液中輕輕混勻，緩慢加入6孔板中，于37 ℃，體積分數(shù)5%CO2，100%濕度條件下培養(yǎng)5 h，棄去培養(yǎng)基，換為含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，24 h后換為含血清含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入含800 μg·L-1 G418的DMEM完全培養(yǎng)基，1周后見對照孔的細胞大量死亡，轉染陽性細胞生長狀態(tài)良好，將轉染陽性細胞接種于96孔板，用連續(xù)稀釋法挑選陽性單克隆細胞，每個96孔板大約可以挑選出6～10個單克隆，待單克隆細胞在96孔中生長至80%融合，用胰酶消化后接種于6孔板中，G418濃度降為600 μg·L-1,待細胞長至80%融合后傳入90 mm2培養(yǎng)皿中，待做進一步的鑒定。將穩(wěn)定表達野生型PINK1蛋白的單克隆命名為PINK1-SY5Y細胞株。

　　1.2.3  PINK1基因DNA水平的檢測 

　　收集培養(yǎng)細胞，計數(shù)約106～107，按照試劑盒說明書提取基因組DNA，設計上游引物PINK1-myc-His-F：5′-CCAA-GCTGGCTAGCGTTTAAACG-3′ 融合His標簽下游引物PINK1-myc-His-R：5′-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG-3′，在10 μL反應體系中加入gDNA模板1 μL，10×PCR緩沖液1 μL，dNTP 0.2 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA多聚酶0.2 μL，PCR H2O補足10 μL，采用Touch-down方式行PCR擴增，反應條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃ 60 s；68 ℃ 30 s；每個循環(huán)下降1 ℃；72 ℃延伸1 min,10個循環(huán)；然后95 ℃、30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，擴增產物約為1.8 kb大小，行瓊脂糖凝膠電泳。

　　1.2.4  PINK1基因mRNA的檢測
 
　　收集對經測序驗證序列正確的單克隆細胞，計數(shù)約106～107，按照試劑盒說明抽提制備總RNA，應用紫外分光光度計測定總RNA 的OD值，經瓊脂糖凝膠電泳擴增，確定所提取的總RNA無降解后，用逆轉錄試劑盒制備第一鏈cDNA，PCR檢測mRNA的表達。具體操作步驟如下：采用Trizol一步法快速提取重組質粒轉染的SH-SY5Y細胞的總RNA，于55 ℃，60 min合成第1鏈，以P1、P2為模板，按照RT-PCR試劑盒說明書進行跨外顯子RT-PCR的檢測。反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)；然后72 ℃充分延伸20 min；同時設立空載體轉染的SH-SY5Y細胞作為陰性對照。目的基因PCR產物用1 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分析。

　　1.2.5  PINK1蛋白表達的檢測 
　　
　　采用抗His抗體來檢測PINK1蛋白的表達情況。具體方法為：待細胞生長至90%融合，收集并裂解細胞，測定蛋白濃度，稀釋使蛋白濃度為1 mg·mL-1,100 ℃變性5 min,行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，與1500稀釋的鼠抗His抗體4 ℃搖床孵育過夜，PBS-T洗膜4次，每次15 min，然后與15 000稀釋的辣根酶標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫搖床孵育1 h,PBS-T洗膜6次，每次15 min，發(fā)光液均勻涂于膜上，曝光3～5 min后顯影，將顯影條掃描。

　　2  結果

　　2.1  重組質粒的酶切鑒定 

　　PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B質粒酶切后野生型PINK1產生約1.7 kb的條帶，PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B重組質粒中的插入片斷與GeneBank中報道的PINK1 cDNA序列完全一致,將其野生型命名為PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B。見圖1。

　　2.2  PINK1基因DNA的表達 

　　轉染空質粒載體的SH-SY5Y細胞，未擴增出目的基因片斷，轉染野生型PINK1基因的單克隆，擴增片斷長度約1.8 kb，并可見轉染野生型PINK1基因的假陽性克隆,PINK1基因CDS全長PCR擴增產物見圖2。

　　2.3  PINK1基因mRNA的表達 

　　提取的總RNA OD260/280值均大于1.9，經瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S、18S、5S 3條核糖體RNA泳帶完整清晰，表明總RNA無明顯降解，見圖3。經RT-PCR擴增后的PCR產物可見野生型PINK1產生約425 bp的擴增產物，其中未擴增出425 bp產物的為假陽性克隆，正常轉染空質粒載體的SH-SY5Y細胞組中未見擴增產物表達。見圖4。
　　
　　2.4  PINK1蛋白的表達 

　　正常SH-SY5Y細胞及轉染空質粒載體的SH-SY5Y細胞組未見到PINK1-His融合蛋白條帶，轉染野生型PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B重組質粒載體的SH-SY5Y細胞組可見特異性的分子量約為62 000的目的條帶,見圖5。

　　3  討論

    用轉基因技術構建轉基因細胞模型是研究帕金森病發(fā)病機制的重要途徑，目前將基因導入真核細胞的方法有脂質體轉染、磷酸鈣沉淀等生化轉染方法、電穿孔物理轉染方法以及病毒介導的轉染。陽離子脂質體介導的轉染法，容易透過細胞膜，在體外基因轉染中有較高的效率，是目前常用的的轉染方法之一。作者選擇了pcDNA3.1-myc-his(-)B 質粒載體來構建野生型PINK1真核表達載體，引入標記物His以便于檢測。構建的載體PINK1-His融合表達蛋白載體，由于PINK1蛋白的單克隆抗體來源困難，因此采用抗His抗體來檢測PINK1蛋白的表達情況。His是一種分子量很小的標記物，大小約為相對分子質量1 000左右，與目的蛋白融合在一起所形成的融合蛋白基本上具有目的蛋白所有的生物學功能，一般不會改變目的蛋白的運輸、組裝、分泌和代謝等正常生理功能。

    PINK1基因是2004年克隆的與AREP相關的基因［3］，是AREP的常見致病基因，僅次于PARKIN基因，是由581個氨基酸組成的高度保守的鈣調蛋白激酶家族成員，是鈣調蛋白激酶的類似物，在人腦中廣泛表達，定位在線粒體膜上，有1個34個氨基酸組成的N末端線粒體定位結構域和1個354個氨基酸組成的絲-蘇氨酸蛋白激酶結構域及1個C-末端自動調節(jié)結構域，在體外有自磷酸化作用，PINK1蛋白溶解度極低并有聚集的特性［6-8］，這可以解釋為什么散發(fā)性PD患者中10%的路易體內可以檢測到PINK1 蛋白。

    PINK1基因功能缺失突變約占早發(fā)性PD患者1%～7%，目前已經有20余種突變報道，PINK1基因雜合突變也有報道，被認為也是晚發(fā)性PD的危險因素，PINK1 基因的發(fā)現(xiàn)第1次使線粒體功能障礙與AREP間有了直接聯(lián)系的證據(jù)。過表達PINK1蛋白可以阻止細胞線粒體膜電位下降及MG123誘導的細胞凋亡［3，9］，而過表達PINK1致病突變（E240K，L489P and K219M）可以使PINK1功能失活而不能保護細胞在基礎及誘導情況下的細胞凋亡。PINK1基因突變的表型與PARKIN非常相似，過表達PARKIN可以挽救由PINK1突變導致的線粒體功能障礙［10-11］。在正常及凋亡應激情況下，過表達野生型PINK1基因通過抑制細胞色素C的釋放及相應的caspase激活起到抗SH-SY5Y細胞凋亡的作用。RNA干擾調節(jié)的PINK1基因失活果蠅模型導致進行性多巴胺神經元丟失，抗氧化劑SOD可以抑制這種神經變性，表明PINK1基因失活后可以通過氧化應激途徑誘導神經細胞死亡。PINK1基因很可能通過磷酸化某些線粒體蛋白，調節(jié)它們的功能而發(fā)揮其保護作用。TNF-受體相關蛋白1，一種線粒體分子伴侶，也被稱為熱休克蛋白75，是目前報道的PINK1的細胞內下游底物，體內體外實驗均證實PINK1與HTRAP1在線粒體結合并磷酸化HTRAP1，保護氧化應激誘導的細胞凋亡，證明PINK1對細胞的保護機制依賴于對HTRAP1的磷酸化［12］。PINK1基因功能的進一步研究對于揭示AREP的發(fā)病機制及靶點治療具有非常重要的意義。

    本研究以人胎腦cDNA文庫為模板獲得PINK1基因cDNA編碼區(qū)全長序列，插入到pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表達載體內，PINK1基因CDS全長1 746 bp，5′端GC含量高，二級結構復雜，故采用2次PCR以獲得其CDS全長，成功構建了野生型PINK1基因的真核表達載體，將該載體轉染SH-SY5Y細胞，經過G418篩選陽性單克隆株，提取全基因組DNA進行擴增，并利用反轉錄-聚合酶鏈反應、Western blotting 檢測到PINK1基因在DNA、mRNA水平的整合、轉錄及蛋白水平的表達。綜上所述，本研究成功建立了在基因組DNA中穩(wěn)定整合有野生型PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B載體的SH-SY5Y細胞株，為PINK1基因的功能研究提供了1個轉基因細胞模型，為 PINK1基因的功能特性及與AREP發(fā)病機制之間的關系的研究奠定了基礎。

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