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ELISA法檢測乙肝兩對半影響因素分析與對策
南方醫科大學附屬中山博愛醫院 黃道連
關鍵詞: ELISA 乙肝兩對半 影響因素 分析
ELISA法廣泛用于乙肝兩對半檢測。但ELISA測定中影響因素較多，有些因素會導致結果假陽性或假陰性,本文就ELISA測定乙肝兩對半的影響因素及對策報作如下討論:
1． 樣本采集與處理的影響
1.1標本嚴溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽性，嚴重溶血標本禁用。
1.2采血試管洗滌不徹底、反復使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關；EDTA鈉或鉀鹽、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性。
1.3標本凝固不全 ，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標板孔壁內使酶標記物不易洗掉，易造成假陽(陰)性結果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。
2、試劑的影響
2.1乙肝兩對半試劑廠家較多；不同廠家出產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示[1]，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78~89%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩定比較差。使用質劣的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之一。
2.2不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結果為陰性，而電化學發光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。
3、操作技術的影響
3.1加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結果。由于吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗，定期校準。
3.2溫浴影響，96孔酶標板結構特別；易產生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內部孔升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。
3.3冼滌是ELISA操作的重要環節，手冼條件一致性較差，對結果影響較大，半自動與全自動冼板機使用不當也會影響結果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態，造成未結合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清冼幾遍。
3.4肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結果一致性。
4、HooK效應影響
隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產生HooK效應。影響檢測結果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應的發生。
5、干擾物質的影響
有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果；常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質和其它物質等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發生變構，Fc的C1q分子結合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深影響檢測結果。
6、藥物的影響
6.1、高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產的生新兒也常出現HBsAg陰性，HBeAg 陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內與胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物；則新生兒HBsAg檢測呈陰性；用0.5M的鹽酸處理標本1小時可提高出率[2]。
6.2、為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學發光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內不應作HBsAg檢測。
總之，乙肝兩對半檢測必須排除各種影響因素的干擾才能為臨床提供正確可靠的檢測結果。
參考文獻：
1、張彥等，廣東省常見乙肝檢測ELISA試劑的抽樣調查，數理醫學雜志，1996，9，（4），352-353
2、林晨等；酸解離HBsAg免疫復合物以提高HbsAg檢出率的探討，上海醫學檢驗，1995，10，（3），167。
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