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| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.pyjb.com.cn |
八十年代以來由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其嚴重的危害性而受到人們高度重視，力爭早期診斷和尋求有效治療是防止其廣泛傳播的關鍵所在.聚合酶鏈反應(PCR)具有敏感、特異和快速的特點，是檢測病毒、評價病情進展和探討發病機理的有效工具. 一、HIV的基因結構 HIV的基因結構與其它逆轉錄病毒基本相同，為RNA雙分子，其單鏈RNA分子由9749個核苷酸組成，有3組共9個基因。第一組為逆轉錄病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及側翼的長末端重復順序(LTR)等.其中前三者為病毒的結構基因，編碼病毒蛋白，而基因組兩端的LTRs，不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達，無種屬特異性.第二組為調節基因表達的基因，即tat、rev和nef基因，可以增強或抑制其它基因的表達.第三組為特有基因，負調控病毒的感染性，成熟或釋放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遺傳變異率，它是一個多態性病毒，從不同的AIDS患者體內分離出的病毒結構表現出一定的差異，事實上，獨立分離到的HIV-1和2彼此都不相同，這是由于病毒傳播過程中突變，缺失或插入引起的，高度變異區在env基因內，相當于gp120的五個區段，gag和pol基因較少變異，因此，只有選擇病毒基因組中高度保守區域作為目的基因加以擴增，才能有效地檢測所有HIV的變異性.目前已知HIV有兩個型，HIV-1是從歐洲和美洲分離毒株的總稱，亞洲地區的流行株也基本上為HIV-1，HIV-2是從西非的妓女分離的毒株. 二、PCR在鑒定HIV感染中的意義 HIV常可引起潛伏感染，但仍具有傳染性，整合的病毒基因組在每個細胞中僅以很低的DNA拷貝數存在，因此，需要建立一個敏感而又特異的HIV檢測方法.傳統的檢測途經很多，包括外周血抗原測定，病毒分離和逆轉錄酶法等，但均費時費力，穩定性也差.核酸雜交雖有一定的特異性，敏感性卻較低，利用原位雜交發現AIDS患者僅有104～105之一的細胞有含有HIV-1DNA，實際上遠不至此.聚合酶鏈反應被稱為無細胞的分子克隆技術(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用針對HIV-1LTR，gag和env基因的三對引物對HIV血清學和病毒分離均陽性與血清學陽性，但病毒分離陰性的男性同性戀者進行外周血單個核細胞(PBMC)前病毒DNA序列的測定，發現前者的陽性率為100%，后者也可達60%，對照組則均為陰性，因此提出PCR可以作為病毒分離的替代方法.Imagawa將PCR與其他幾種傳統方法進行比較，結果在分離出HIV-1前，具有血清陽轉的4例男性中3例可用PCR檢測出外周血淋巴細胞中gag基因的存在，這種陽性反應可發生在血清陽轉前38～42個月，而在得出PCR陽性結果前，無一例分離出病毒，因而認為，對仍從事高危活動(如吸毒、同性戀等)的血清陽性個體，PCR能有效地發現HIV感染者的存在.此外，臨床上AIDS患者常出現神經癥狀，而在許多血清學陽性個體的腦脊液(CSF)中卻未分離出HIV-1，因而難以確定病毒的侵襲范圍.利用PCR技術已經證實了CSF中存在著前病毒DNA和游離病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更為豐富.至于CSF中病毒序列的存在是否與神經系統的損害有關，目前仍存在不同意見，但至少無癥狀感染者CSF中HIV-1的存在對闡明與HIV-1相關的神經損害具有重要意義. 研究表明，HIV感染的女性所生的嬰兒中有30～59%可在宮內、分娩過程或產后哺乳期感染該病毒，但由于嬰兒體內存在來自母體的抗體且可持續15個月左右，同時又缺乏檢測IgM型抗體的手段等原因，使得傳統方法在鑒定新生兒是否感染方面受到限制，及時地對新生兒作出診斷，對于其獲得早期治療具有積極的意義.PCR技術所需標本量少，對新生兒、嬰兒的診斷尤為適用.Roger用PCR對血清陽性母親所生的23例兒童從新生兒開始進行外周血前病毒DNA的跟蹤監測，結果表明，在后來發展為AIDS的7例兒童中，有5例在新生兒期即存在病毒序列，而血P24抗原卻檢測不到;具有AIDS非特異表現者，也有4/14在新生兒期呈陽性PCR反應;由這些母親所生的健康兒童和陰性對照組則均為陰性，說明本方法的特異性和靈敏性極高.Soeiro進一步用PCR法證實了宮內感染的存在，采集了23例AIDS或血清陽性母親的流產兒組織，進行PCR擴增，并作原位分子雜交比較，結果有7例用PCR檢測到HIV-1DNA，而原位雜交只有1/8流產兒組織呈陽性反應. 由于HIV具有高度的變異性，使得AIDS的治療顯得頗為棘手，現已發現體外病毒分離株對AZT易感性降低.Richman利用一對寡核苷酸引物對接受AZT治療者的外周血進行PCR擴增，得到的535bp的片段中含有與AZT耐藥性有關的4個逆轉錄酶基因突變位點，而且突變數目與耐藥程度成比例，因此，PCR能有效地監測毒株的耐藥性.利用env基因的高度變異性，對該基因特異性擴增后進行病毒分型，對于監測毒株的變異及分子流行病學的研究具有十分積極的意義;對分娩健康嬰兒的AIDS女患者HIV基因的擴增及分析，也有利于探討母嬰垂直傳播的條件及毒株的特點，從而研制出有效的疫苗. 由此，我們可以看出，PCR技術在鑒定HIV感染方面具有重要的意義，它可檢出抗體出現前的感染者，篩選新個體，確定病毒類型和耐藥毒株，區分兒童感染的時間，并可作為AIDS的預后指征. 三、HIV感染的定量PCR研究 目前檢測體內HIV活性的方法有限，雖然循環血CD4+細胞計數、血清P24抗原、新喋呤、β2-MG等曾用來指示HIV感染時病毒的水平，其敏感性和特異性均受限，定量培養又費時昂貴.定量PCR是HIV感染中直接測定病毒本身的最佳途徑.早期首先采用有限稀釋法，即將所采取的HIV感染者標本進行梯度稀釋后分別進行PCR擴增，以反應陽性的最大稀釋度 作為病毒水平，缺點是不能給出病毒的絕對拷貝數.后有作者用含有已知量的HIV序列的質粒DNA作為模板進行系列PCR反應，然后以擴增產物量對初始模板量得出標準曲線;待測標本用相同體系擴增后從標準曲線中求得所加標本量，從而推算出樣品中HIV的感染水平.但在反應過程中既使嚴格控制實驗條件和操作步驟，同一份標本在不同的試管內也存在著擴增的差異，即所謂的“試管效應”，因此，為了使PCR定量客觀標準化，又引入了內參照來消除這種差異，如利用HLADQα基因與HIV感染標本用各自的引物在同一管中擴增，前者模板量已知，且作一系列梯度管，后者以一恒定的未知量參與反應，后用前者擴增的標準曲線來計算后者的初始模板水平，但缺點是這種內參模板的擴增效率與HIV的擴增效率不同. 從理論上講，在PCR反應中應存在著這樣一種關系，即Y=S(1＋e)n，Y指擴增后拷貝數，S是初始拷貝數，n代表循環次數，e指擴增效率.由于PCR對反應條件和初始模板量高度敏感，因此e值變異很大，可在0～1范圍內波動，近年來在克服上述各種方法缺點的基礎上而建立起來的競爭性定量PCR(QC-PCR)對HIV感染的定量分析已顯示出廣泛前景.其基本原理是人工設計與待測靶序列基本相同但能夠區分的突變體(包括缺失、插入和限制性酶切位點突變)作為競爭模板，并以不同比例與一定量的靶序列共同混合于同一反應體系中，在相同引物介導下，兩種模板共同擴增，當某一管中兩種擴增產物的量相等時，該管中的已知競爭模板濃度即為靶序列的初始模板濃度.Piatak以HIV的高度保守區域gag基因作為靶序列，用含有HIV基因組的質粒為模板，設計引物用PCR方法合成一內部缺失80bp的gag片段，然后將此片段重組克隆后作為競爭模板.與待測標本共同擴增后的產物由于分子量大小不同，可用瓊脂糖、聚丙酰胺凝膠電泳及密度掃描等計數結果，從而確定起始模板數.該方法在目前而言是一種相對客觀而準確的定量途經，但其缺點是每測一份標本需設系列管，比較麻煩，造價昂貴，試劑盒難于推廣. 最近美國AcuGen System研制了一種新的封閉式定量PCR系統，將生化、計算機和光電技術相結合，并采用專用試劑，從擴增的DNA直接做定量數據的讀取和分析，免除了傳統的電泳，照相等步驟，也排除標本污染的可能性.設備由三部分組成，定量讀數器，擴增儀和計算機.其定量模式是根據能量轉換原理設計.在PCR擴增到一定程度時，加入一信號試劑，即萬能信號雙鏈體，它是由互補的寡核苷酸鏈組成，該寡核苷酸鏈分別由具有熒光能量轉換的供受者加尾修飾，連接在擴增引物的5'端，這種連接穩定了信號雙鏈體，并建立了熒光能量轉換反應，因為穩定結合在一起的雙鏈體接受光后會發生能量轉換.當以后的循環開始后，新生鏈開始產生，引起這種結合的引物雙鏈體變為單鏈，接受光的能力下降，發生能量轉換的全部瓦解.熒光信號隨著循環次數的減少而被測量出來，以計算特定擴增片段的不斷累積量.目前國內已有這種HIV檢測試劑盒出售，但由于設備及試劑均很昂貴，限制了它的廣泛應用. 對體內的病毒水平作準確的定量分析，有助于對感染過程的各期作病因性分析，觀察藥物的療效，更好地指導治療.Bagnarelli用QC-PCR法檢測33例HIV感染者外周血標本中病毒的拷貝數及轉錄情況，結果提示，病毒拷貝數與疾病進展和CD4+淋巴細胞計數減少之間存在著與高度相關性，在疾病的各個階段均存在著HIV-1結構基因的特異性轉錄和復制.有趣的是，盡管隨著疾病的進展，病毒血癥不斷加重，但AIDS患者的個別感染細胞的轉錄活性僅中等度地高于無癥狀感染者.此外，血漿中HIV-1基因組RNA定量，似乎是更為可靠和敏感的病毒活性的標志.另有作者用定量PCR發現AIDS患者血漿中HIV-1數量明顯高于無癥狀血清陽性者，在每8～14周口服ddT劑量≥6.4mg/Kg.天的患者，其血漿HIV-1顆粒數量明顯降低，提示循環中游離病毒量與HIV-1的感染性滴度、CD4<400/mm3、HIV相關癥狀的存在和藥物治療密切相關，也說明PCR是監測這些指標的有效方法. 在HIV-1感染過程中，與免疫功能密切相關的細胞因子有無變化，是探討其免疫致病機理的重要一環，由于細胞因子在血清中水平很低，僅達Pg水平;血清半衰期短，約數分到數小時，而且分泌后很快與受體結合，使得臨床標本的檢測成為困難.Fan利用PCR法分析了HIV-1感染者外周血細胞因子mRNA水平的變化，以β-actin作為內參照，對各種細胞因子mRNA水平定量，可精確至10個拷貝的mRNA.結果表明，血清陽性的男性同性戀者PBMC中IFN-γmRNA水平升高，而IL-2mRNA水平卻下降，隨著病情進展，這種變化更為明顯;CD4和CD8細胞中這些細胞因子mRNA水平也不相同;所有細胞因子在HIV感染后期表達均下降. 四、PCR的相關問題 1.模板的選擇和提取 艾滋病患者和HIV感染者的血液和各種體液中均含有一定量的病毒.目前作為診斷和研究的標本多采用外周血，因為HIV是一種嗜T細胞性病毒，其中模板量豐富且易保存，因此從PBMC較易得到HIVDNA，另外血漿中存在的游離病毒也可以作為提供模板的原料.HIV也常侵犯單核細胞、巨噬細胞、神經母細胞和皮膚的郎格罕氏細胞，所以也可采取除血液外的腦脊液和表皮組織提取模板來擴增，以探討其致病機理.由于艾滋病多由性傳播引起，因此唾液和精液也存在較低量的病毒顆粒，而且已用PCR發現雖然精液中存在HIV-1DNA，但精子細胞中卻缺如，用PCR對這兩種體液中病毒的檢出對疾病的預防有重要意義. 傳統PCR中模板的提取包括細胞裂解，酸氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀核酸等過程，步驟繁多.現在多數作者傾向采用粗制細胞裂解液或冰凍血液直接進行擴增.Albert將HIV感染者PMBC在含有SDS.tritonX-100和蛋白酶K的裂解液中處理后，直接將此混合物用于擴增，證明其非常適合于PCR過程.濾紙干血斑標本(DBS)的應用使標本采集更加簡便，它采用指血，特別適合于圍產期篩查和高危人群的分子流行病學大面積調查.Cassol測定了在模擬現場條件下保存DBS標本的穩定性和反應性，證實經過凍融、于22℃下保存22周或37℃和60%濕度下孵育7天的這種標本的DNA完整并適用于擴增分析，且低HIV拷貝數的DBS于上述條件下保存，PCR反應性也未降低.對AIDS患者和HIV感染者DBS標本的驗證實驗，均產生較強的PCR信號. 2.選擇合適的引物，改良條件提高敏感性. 這一點在許多文獻中均已報道主要原則為:1.減少設計引物的序列與HIV相關病毒或人細胞DNA的同源性;2，選擇的引物要盡量處于HIV基因組的高度保守區，如gag、env、pol、tat基因中的某些核苷酸序列;3.盡量保證引物3'端的堿基與模板的匹配，引物內無一級結構和重復性，引物間和引物內不能有互補序列.常用的引物及位置見表1. 其次，PCR反應過程中多對引物的應用漸趨增多，由于HIV的高度變異，單純一對引物的擴增結果已被認為不夠確切，至少需要兩對引物擴增才能鑒別陽性反應的存在.事實上，多對引物的應用可明顯提高PCR的敏感性，Albert通過4對引物的應用，使100%的HIV感染者得到陽性擴增.套式引物PCR也能明顯提高HIV感染檢測的敏感性，并被用于AIDS患者病毒水平的定量研究中.Bagasra為使HIV感染的定量分析更加準確化，以細胞本身作為反應管，采用原位PCR，擴增完整細胞中的基因片段，發現外周血中感染的PBMC頻率為0.1-13.5%，明顯高于普通PCR;結合免疫磁珠分離技術，發現某些疾病進展者其CD4細胞比例增高，其HIV感染的CD4細胞水平也較高. 3.結果的檢測 標本中模板得到有效的擴增后，必須客觀地檢測出來，一般多采用瓊脂糖凝膠電泳后目測觀察特異性擴增條帶，必要時可采用聚丙酰胺凝膠電泳以提高分辨率.但有時這種方法達不到足夠的敏感性，Keller報道了一種改良的探針檢測法，引物與HIV-1gag基因互補，且5'端以生物素標記，擴增的產物既作為標本又作為探針;再設計一種“捕獲”探針，其序列正好位于兩引物之間，但不與引物重疊，這樣避免了假陽性結果的出現.生物素化的PCR擴增產物在微量滴定板中被捕獲，然后再與鏈霉親和素一過氧化物酶結合物和四甲基聯苯胺底物反應，用比色法測定，這種方法靈敏性和特異性大大提高.在QC-PCR中，為精確算出病毒拷貝數，將dNTP中的一種用放射性核素標記，經過30～50個循環后，PCR擴增產物即具有放射性.回收電泳膠帶，分別測定二者的放射活性，根據不同濃度突變模板與標本的混合和擴增產物的放射性強度之間的關系，可以精確算出標本中DNA拷貝數.但由于使用同位素存在半衰期短，危險等缺點，雖可精確定量，卻限制了PCR的實際應用，現也采用PCR-EIA(酶免疫法)來對HIV感染水平定量，來克服使用同位素的缺點.另外目前有些實驗室中采用的電泳后EB染色凝膠的密度掃描也可借鑒. PCR檢測HIV中常用的引物和探針
總之，PCR術在HIV感染研究中的應用已獲良好效果，在目前亞洲地區HIV感染增長速率十分迅猛的情況下，開展此項技術的研究對于我國艾滋病的防治有著十分重要的現實意義. |
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