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董培智 (山西省藥品檢驗所太原 030001 peizhid@263.net)
鱟試劑法是利用鱟血細胞溶解物與微量(pg/ml級)細菌(主要是革蘭氏陰性細菌,G-)的內毒素反應,從而檢出被檢物中內毒素的一種生物體外檢測新技術.因為其具有快速、簡便、經濟、靈敏度高、重現性好、一次可同時測幾個樣品等優點,自從一九六四年美國學者Levin 和 Bang發現此法以來[1],鱟法正被日益廣泛地應用于醫藥衛生、食品衛生、環境衛生、分子生物學、以及微生物學中. 鱟法大致可分為凝膠法、比濁法色原基質法、以及免疫法等.本文依據文獻報道,總結了近年來國內外學者在用這些方法測定細菌內毒素時發現的一些影響因素及其消除方法的研究進展,以供試驗者參考. 1 試驗條件與操作培養條件、操作環境可能引起各次實驗之間、各實驗室之間的結果差異[2]. 1. 1 時間 鱟試劑在液態時極不穩定, 室溫放置太久會影響反應靈敏度,故加樣結束后,應立即放入恒溫水浴中. [3]延長保溫時間,可提高LAL的靈敏度.[4] 有研究者[5]發現細菌內毒素國家標準品和工作標準品的不同混合時間與相對活性之間具有一定的規律,即５分鐘時混合點的活性最強,混合時間越長,活性反而降低,但在三十分鐘以內的各混合點測定的靈敏度均在規定范圍之內. 在顯色法中靈敏度與時間有關,故實驗過程中既要嚴格控制每個環節的保溫時間,又要嚴格控制終止時間[2][6][7]. 1．2 溫度凝膠試驗規定的孵化溫度為37℃.但在夏季高溫季節,如果同時作幾個樣,陽性對照不成立的現象時有發生,故應改為冰浴.[3] 郭錄平[4]通過實驗證明,保溫在25-41℃內,隨著溫度的升高,LAL的靈敏度也隨著升高；在41-46℃之間,對靈敏度無明顯影響；≥48℃會破壞鱟試劑. 另外在顯色法中的靈敏度也與控制溫度有關[6][7]. 1.3 pH值 高國政等人[8]用動態濁度法詳細研究了樣品pH 值對細菌內毒素測定的影響,結果發現:樣品 pH 在6-8間實驗結果穩定；pH ≤3 或≥12時,實驗受到抑制,平均回收率≤56.8%.最后得出結論:使用TAL 時,供試品 pH 應預調在6.5-7.5 為好；使用 LAL 時,pH 應預調在6.2±0.1或 6.7-7.8為好. 也有人認為[4][7][9] 鱟試驗的 pH 應為6.5-8.5,以7.0-7.5為佳.必要時可用無內毒素的 HCl 或NaOH 調節 pH 值[2]. 1．4 試驗器具 內毒素稀釋不宜用注射器,而應用經過校正的刻度吸管.因為注射器刻度不準,而且,針栓壁磨沙面易吸附內毒素而使其濃度不夠,造成凝膠反應不成立[3][10]. 普通玻璃及塑料管也會影響實驗結果[2][9],用硬的玻璃管及AR玻璃管較為合適.一般硼酸玻璃管測得的效價較低,而且LAL的靈敏度愈低,管對測定的結果影響愈大.操作中常用的聚丙烯塑料管可能干擾結果. 1．5 操作程序有實驗者發現[3][11]:操作次序也影響試驗結果.應該先吸取供試品、然后加入陰性對照及陽性對照液,最后按供試品管、陽性對照管、陰性對照的順序逐一精確加入鱟試劑.未按此程序容易出現陽性反應不成立的現象. 1.6 處理作用 Pedersen MR和Hansen EW[12] 將內毒素溶液用玻璃試管干燥,在氧丙環(Ethylene Oxide,EO)450或900mg/l中暴露1-46小時后,內毒素的LAL活性減少至百分之三十.將多粘菌素B(Polymyxin B,PB)加入到內毒素稀釋液中會減少其活性百分之七十五.內毒素經過EO處理會減少LAL活性百分之七十,進一步加入PB會減少LAL的活性百分之九十九.EO對內毒素的反應會減少其LAL活性,也會減少其熱源反應,增加與PB的親和性. Bamba T[13] 等學者研究了平滑型G-細菌的內毒素(Smooth gram-negative bacteria ,S-form)經過高溫蒸氣處理后的滅活效果,觀察到不同種細菌的抗熱性顯著地不同,減弱率與濃度有關.低濃度(10ng/ml)內毒素處理后的活性可降低至可測定的限度下.粗糙型(Rough strains,R-form) 細菌的內毒素減弱時間曲線與個別平滑型相似.平滑型,尤其是Rc突變體(Rc mutant)細菌的內毒素滅活性能夠被Mg2+,Ca2+等二價陽離子顯著影響. FDA認為不同的產品處理和儲存條件可能會引起對某一樣品試驗的分析誤差.Guilfoyle DE [14]等人通過實驗發現培養細菌的培養基以及溶劑的儲藏溫度均不會引起任何問題.然而,因為溶液在瓶中沒有充分震蕩,溶劑與橡膠塞接觸,約有百分之二十到四十的內毒素丟失.解決此問題的方法是應將試劑直立地存放在無污染的瓶中,并規定在內毒素試驗之前統一的混合步驟. 姜素云等[15]通過考察細菌內毒素的穩定性后發現,溶解后的細菌內毒素應用液(0.5-1.0Eu/ml)在0-4 ℃ 放置一周活性不變；1.0-20Eu 應用液若置冰箱,可冷凍保藏20天,但反復凍融活性會逐漸降低. 2 供試品 2.1 多糖[2] 我們已經知道每毫升含皮克級的內毒素會使鱟試劑呈陽性,而多于10pg/ml濃度的產堿桿菌多糖(1-3-β-D-葡聚糖)(curdlan,1-3-beta-D-glucan)也會使常規的內毒素實驗呈陽性,因為LAL中含G因子[16]. 據報道[17][18],能激活鱟試劑旁路(G 途徑)的物質主要是(1-3)-β-D-葡聚糖(包括(1-4)-β-D-葡聚糖和(1-6)-β-D-葡聚糖)以及LAL-RM(LAL-Reaction Material)兩類,如真菌多糖(Fugal polysaccharide)、中空纖維濾膜洗滌液、腎透析儀(人工腎,血液透析儀)洗滌液等.實驗室常用的酒精,棉球等也含有較多的(1-3)-β-D-葡聚糖.低于一定濃度的(1-3)-β-D-葡聚糖或LAL-RM不足以使鱟試劑的凝集反應產生陽性結果,但如果有細菌內毒素共同作用的情況下,凝集反應會變得更為激烈和迅速,很容易使反應出現陽性結果.我國已生產出含有能抑制或阻斷鱟試劑G因子旁路反應物質的試劑—增抗液(Antienhancement Solution). Cooper JF 和 Weary ME[19] 等學者發現商品的LAL試劑對葡聚糖的反應存在很大的差異,所以實驗室間LAL實驗的結果可能出現矛盾.動態LAL方法(Kinetic LAL methods)對篩選可能被葡聚糖污染了的物質非常有用.葡聚糖在非口服制劑中不常見,只限于被微生物或纖維素物質污染的產品.并設計了一種能確定葡聚糖存在與否的LAL試驗方法. 另外,丹麥科學家[20]發現,細菌內毒素與鱟試劑的凝集反應可被二甲亞砜與多粘菌素B (dimethyl sulfoxide and polymyxin B)合用,或抗鱟C因子的單克隆抗體(monoclonal antibody against Limulus factor C)所抑制.他們還發現β-葡聚糖(beta-glucan)激活途徑能完全被昆布糖(laminarin)所阻礙,而不影響內毒素的激活途徑.人血漿與LAL反應是通過β-葡聚糖途徑激活的,而非內毒素途徑. 八十年代后,日本最先研制成功只與內毒素起反應的特異鱟試劑,如:Endospecy,以及只與(1-3)-β-葡聚糖反應的鱟試劑:SLP試劑及Gluspecy.[21] 2.2蛋白 2.2.1陽離子蛋白 幾位德國科學家[21]發現陽離子蛋白(Cationic proteins)如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G (lysozyme, ribonuclease A, and human IgG)能夠與細菌內毒素形成細菌內毒素-蛋白復合體,對細菌內毒素有顯著的屏蔽作用,從而影響用鱟法來測定細菌內毒素.試驗證明,苯酚提取法、稀釋加熱法、以及高氯酸處理(phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment)等方法都不能夠解除此作用.胰島素、糜蛋白酶、鏈酶蛋白酶(trypsin, chymotrypsin, or pronase)等只能回收10%-20%的內毒素,然而如在測定之前,用蛋白酶 K (proteinase K)來消化樣品,可使細菌內毒素的回收率達到百分之百.進一步研究還發現,多聚-L-賴氨酸及多聚二甲亞胺(poly-L-lysine and poly ethyleneimine)作為細菌內毒素選擇性配位基能夠將細菌內毒素從所研究的蛋白上脫去,從而有利于進一步的測定. 2.2.2 血蛋白 Roth R與IKaca W 證明[23][24],血紅蛋白能與LPS結合,這種結合會改變LPS的一些物理特性,從而增強了LPS的生物學活性及LPS與LAL的作用. 據報道[2][17][18]:人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子.有學者的研究表明用一般鱟試劑測定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽性檢出率明顯高于用去G因子LAL測定的陽性率,而后者與兔熱源檢查結果基本一致. 2.2.3 免疫蛋白 Baek L[25] 等人通過免疫電泳方法表明,假單孢綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞膜的一些可溶性抗原(Soluble antigens)與LAL能夠反應. 有的學者[26]用鼠單克隆免疫球蛋白M抗體E5( mouse monoclonal IgM antibody E5)來測定其抗不同菌種LPS的活性.結果證明,由于細菌種類不同,經E5處理后,LPS活性減弱的程度也不同,一般地0.2mg/ml以上的E5能減少幾乎所有被研究菌種的LPS對鱟試劑的活性. 另據報道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途徑. 2.3 離子 離子對細菌內毒素測定結果影響較大[9],因為一方面離子強度較大會引起內毒素的聚集,加重低濃度內毒素不易散的問題；另一方面LAL中的C因子必須在二價陽離子的參與下才能被激活形成活化C因子. Guyomard S; Darbord JC [13][27]介紹了用五種內毒素,即2株大腸桿菌、1株沙門氏桿菌、1株靈桿菌、1株霍亂弧菌(Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)與FDA推薦的內毒素EC5作LAL實驗的重現性.發現添加Mg2+增強了LAL顯色反應(160mmol/l最佳),而Ca2+濃度大于5mmol/l時抑制了此反應,0.3mmol/l的Zn2+會強烈地抑制反應.由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而減弱(160mmol/l).當在反應的第一步(細菌內毒素與LAL孵育)時添加這些二價陽離子會改變LAL顯色反應,而在反應的第二步,即加入生色底物(chromogenic substrate)時這些陽離子則不會改變LAL生色反應. 據報道[7]當鱟血被抽出后,用3% NaCl 充分稀釋(1:500)能阻止變形細胞凝集,即使有內毒素存在也不凝聚,但當有鈣或鎂離子存在時則很快凝固,由此可知鈣、鎂離子對于鱟試驗的作用,但是過量的鈣離子又會影響凝聚作用的完成.因此,當溶液中有EDTA等絡合劑或肝素鈉、檸檬酸鈉等抗凝劑存在時,Ca2+,Mg2+離子將失去作用[2][9],從而影響本法的測定. 有人在研究內毒素的電催化特性對于鱟試驗的影響時,證明釷與鐵對內毒素的活性有強烈的影響,但由于其在鱟血中的含量甚微,故并不干擾實際測定.[7] 生理鹽水中的 NaCl 對顯色反應有干擾[28],但關鍵在于稀釋樣品和標準品須用相同的無熱源水或無熱源生理鹽水. 相反,許多藥物中含有的陰離子會吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子,使實驗呈假陰性,可通過加入0.5mg/ml的氯化鈣溶液,或22mg/ml的氯化鎂溶液來排除干擾.[29] 2.4 有機鹽 核酸鈉(Sodium Nucleinate,NN)像細菌內毒素的LPS一樣能夠被LAL試驗所檢測,有學者[30]還比較了含有NN熱原標準品的兔法與LAL法的測定結果. 2.5 透析液 Berland Y[31]總結了在文獻報導中有關透析液細菌性污染的資料.透析液中的G-小分子熱源物質能夠透過正常的透析膜.纖維性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通過內毒素.聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能夠吸收內毒素.所以,鱟試驗不能夠檢出污染透析液的所有細菌性物質. Laude-Sharp M[32]等人的實驗證明:在體內具有生物活性的多種LPS能夠通過透析膜,盡管在血液中沒有測到LAL反應物質,所以LAL法作為測定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的標準不夠充分. 日本學者 Yoshioka T [33]等人通過使用無G因子的凝集系統證明了從銅氨人造纖維膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反應物質不是內毒素,而是通過另一種途徑使LAL凝集,此物質在循環中滯留相當長的時間.并發現在急性及慢性血液透析中,此反應物質平均水平為100-400pg/ml. 仲衛華[34]等的實驗證明,血液透析液有一定的干擾作用,但可通過稀釋法消除. 以上研究結果說明用鱟試劑來測定透析液中的內毒素的方法還有待于進一步的考察. 2.6 中藥成分[21] 許多種中草藥成分能夠干擾LAL試驗[35],特別是清熱解毒類藥物[29]. 2.7 生化藥品[21] 姜素云[2][36]等證明,氨基酸對鱟試劑有較強的抑制作用. 孔祥文[28]通過實驗證明,基因工程蛋白類藥物生產中常用的 2-巰基乙醇、2-巰疏糖醇和還原性谷胱甘肽對鱟試驗呈色反應有干擾作用,當稀釋到5.0μmol/l時,抑制作用近乎消除. 2.8 其它物質另據報道[2][9][21][29]:人血中的多種凝血因子、可使蛋白質變性物質(乙醇、苯酚)或滅活的物質(如氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑、專一失活劑等)、高糖溶液、絡合物、電解質、維生素、添加劑、右旋糖酐-40、抗凝血劑如檸檬酸及肝磷脂等等,都可干擾鱟試劑形成凝膠.
3鱟試劑與標準品 3．1 鱟試劑內源性因子 Roth RI與Tobias PS[37]在研究含有能被細菌內毒素激發引起凝集反應的內毒素敏感因子的鱟試劑色析組份(chromatographic fraction of Limulus lysate)時,用了一種光復活性的、易解離的、放射性同位素標記(photoreactive, cleavable, radiolabeled)的沙門氏菌LPS衍生物(derivative of Salmonella minnesota LPS),LPS-(P-疊氮水楊酰胺)-1,3-二硫丙胺(LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ,LPS-ASD),來確定LPS-結合蛋白.結果證明LAL組分中較大的82-kDa蛋白是LPS結合蛋白,充當凝集反應的負調節因子,LAL組分中較小的50-kDa蛋白是對LPS敏感的凝集蛋白的選擇物. 日本科學家[38][39][40]發現在日本馬蹄蟹(horseshoe crab (Tachypleus tridentatus))血細胞中存在鱟胞間凝集抑制物(Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor,LICI)1型、2型、及3型.LICI-1專一性抑制對鱟LPS-敏感的絲氨酸蛋白酶(limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease),C因子(K1=2.5×106 M-1,S-1)；而LICI-2顯著抑制鱟凝集酶(limulus clotting enzyme)(K1=4.3×105 M-1,S-1)；LICI-3強烈抑制對(1,3)-β-D葡聚糖敏感的絲氨酸蛋白酶((1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease),G因子(K1=3.9×105 M-1,S-1).因此,鱟血淋巴凝結過程至少由三個內源性因子所調節:LICI-1 是Mr=48,000,有394個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應位點為-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42,000,有386個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應位點為-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53,000,有392個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應位點與LICI-1相同. 3．2 試劑質量 不同批號的鱟試劑標示值相同,但試驗結果不盡相同,尤其是近效者的靈敏度有明顯下降的趨勢.所以在更換批號或者用近效期鱟試劑的時候,應對靈敏度進行復核.以確定本批鱟試劑的實際靈敏度.[3] 有的同志發現[11]:使用不同廠家生產的溶解水來溶解鱟試劑,結果會導致假陽性的出現,而使用同廠生產的鱟試劑及溶解水均符合規定. 另外,還有試驗者發現[41][42][43]:不同廠家與批號的細菌內毒素工作標準品的靈敏度有很大的差別,有的竟低于50% 以下.支與支之間差異竟達50%.[10] 高麗云[44]在實驗中發現如放置半年后重新標定, LAL靈敏度會下降,細菌內毒素工作標準品的效價低于標示量.這可能與細菌內毒素的處方、pH值、冷凍干燥過程以及凍干標準品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加劑影響細菌內毒素的穩定性有關[2]. 參考文獻: 1 Levin,J,and Bang, F. 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注:本文發表在《藥物分析雜志》1999.19卷增
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