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lonza 特殊 無血清 培養(yǎng)基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html 品牌現(xiàn)貨促銷 http://m.pyjb.com.cn/plus/list.php?tid=79
2009年9月15日，Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(miRBase)（http://www.mirbase.org/）升級至14.0版。新增1580條miR序列。至此，miRBase中的microRNA序列信息已超過10,000條。14.0版本共收錄10,581 條成熟miRNA序列信息，通過驗證的microRNA發(fā)夾前體從9,539條增至10,883條，共涵蓋115個物種。收錄于miRNA序列數(shù)據(jù)庫的 miRNA序列數(shù)量越來越多（見圖），有關(guān)miRNA研究的文章和出版物也層出不窮，由此表明，miRNA的研究已經(jīng)成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的研究課題之一。
發(fā)行于不同版本miRNA數(shù)據(jù)庫的miRNA的數(shù)量變化示意圖 更為重要的是科研工作者的研究必須與迅速增長的microRNA數(shù)據(jù)庫保持一致，這是確保研究者不錯失相關(guān)信息的關(guān)鍵。獲得miRBase最新數(shù)據(jù)更新是確保完成miRNA表達譜系分析的唯一途徑。對生物標(biāo)記物研究來講，評估單個miRNA起著重要的作用。在疾病診斷方面，進行miRNA獨特生物標(biāo)記的多重分析，對于疾?。ɡ绨┌Y）的分類或預(yù)后有重要意義。 然而，一個單獨的生物標(biāo)記物往往在特異性及靈敏度方面受限，而miRNA表達譜具有高特異性，因此它可以反映腫瘤的進化譜系和分化。這樣，為了將 miRNA作為診斷標(biāo)記，有必要對其進行多樣性分析。由于高通量技術(shù)的使用例如微點陣分析，能夠區(qū)分單個miRNA，并可以高度精確性地完成miRNA標(biāo)簽信息的收集。 最近，與德國癌癥研究中心（DKFZ）合作的，德國Febit公司通過應(yīng)用Geniom生物芯片系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌病例存在有miRNA生物標(biāo)記物（和文獻報道一致）。應(yīng)用微點陣觀察結(jié)果顯示，與從較老版本的miRNA序列數(shù)據(jù)庫獲取資料相比，使用升級版本數(shù)據(jù)庫（12.0版本代替11.0版本）能夠多獲得25%的信息。在借助生物標(biāo)記物來評估胰腺癌的過程中，使用了新的miRNA，而這種miRNA只能從12.0版本的miRNA序列數(shù)據(jù)庫獲得。這也說明生物醫(yī)藥應(yīng)用與不斷增長的數(shù)據(jù)資料保持一致的重要性。 Geniom生物芯片提供研究者最新的miRNA生物芯片。微流體微點陣系統(tǒng)，具備靈活性以迅速地適應(yīng)新的序列信息?；谧钚聰?shù)據(jù)資料，最佳化的捕獲探針的合成，是直接在生物芯片的微通道內(nèi)完成的，從而保證了芯片的生產(chǎn)和最新microRNA同步的獨一無二優(yōu)勢。吉奧生物和德國Febit聯(lián)合推出了和Sanger miRBase 14.0同步的miRNA表達譜芯片。 如果需要，Geniom生物芯片探針能夠很容易地根據(jù)研究人員的需要而定制。樣本檢測所需時間短，能夠迅速提供可以直接用于發(fā)表的數(shù)據(jù)，因此在競爭激烈的的生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，具有不可替代的地位。 什么是miRNA(microRNA)? miRNAs是一類內(nèi)源性、約22個核苷酸長度的非編碼RNA，具有穩(wěn)定的特異性序列以調(diào)節(jié)基因表達。2001年，miRNAs作為線蟲生長發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)器而被發(fā)現(xiàn)，在病毒、植物和動物體中，miRNAs已被公認(rèn)為主要的調(diào)控基因家族之一，通過mRNA靶向作用降解或抑制其翻譯。 與蛋白編碼基因譜相比，用miRNA表達模式來劃分癌癥類型的可靠性出乎意料(Lu et al.，2005；Rosenfeld et al.，2008)。此外，在常規(guī)收集的、福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的臨床組織標(biāo)本中，miRNAs的表達具有特異性和穩(wěn)定性，更進一步證明其作為診斷性生物標(biāo)記的巨大潛能(Li et al., 2007)。 在哺乳動物基因組中，約有70%的miRNA基因定位于特定轉(zhuǎn)錄單位。他們經(jīng)常存在于蛋白編碼基因的內(nèi)含子處，并且優(yōu)先排列在與其具有相同靶 mRNA的結(jié)構(gòu)處(Kim and Nam，2006)。另一種情況，miRNA基因可能定位于非編碼轉(zhuǎn)錄單位的內(nèi)含子或外顯子處。組織特異的miRNA表達的調(diào)控至今沒有完全闡明。 然而，目前的研究清楚地顯示miRNAs表達與多種人類惡性腫瘤相關(guān)，提示它們代表著一種新型癌癥生物標(biāo)記信號。在特定癌癥中找出相關(guān)的miRNA，能夠提供給我們有用的診斷信息，從而為疾病分類，以及制定出可行的治療方案打下基礎(chǔ)。 產(chǎn)生機制及分子學(xué)功能 miRNA下調(diào)基因表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平(Liu et al., 2008)。miRNP復(fù)合物與特異的mRNA通過堿基配對相互作用，其二者的結(jié)合位點在mRNA的3’端非翻譯區(qū)，他們的Ago結(jié)合蛋白就沉積在 mRNA靶點處。miRNA通過去穩(wěn)定作用或者核內(nèi)裂解mRNA介導(dǎo)翻譯阻抑，這種阻抑作用依賴于miRNA與靶mRNA之間的互補性。miRNA確切的分子功能也依賴于Ago蛋白動員。 如果與Ago2蛋白結(jié)合的成熟miRNA，與靶mRNA完全互補結(jié)合，則引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。mRNA裂解片段通過細(xì)胞旁路被清除，而剩下完整的miRNA。靶mRNA的分裂是miRNA調(diào)節(jié)的優(yōu)化機制(Jones-Rhoades et al., 2006)，動物miRNAs有減退靶蛋白水平的趨勢而無核內(nèi)裂解mRNA(Filipowicz et al., 2005)。另外，成熟的miRNA與只有部分互補序列的靶mRNA結(jié)合，隨后的翻譯抑制可能發(fā)生在起始、延長或終止階段，但是詳細(xì)機制仍待闡明(Wu and Belasco, 2008)。由于完全互補的靶結(jié)合能力不同，每個miRNA可以結(jié)合于多種不同的靶基因發(fā)揮不同的功能，從而調(diào)節(jié)多種編碼基因。詳細(xì)的miRNA靶點預(yù)測仍然是一個挑戰(zhàn)，但是已有許多生物信息手段應(yīng)用于成熟miRNA序列的前2-8個核苷酸即所謂的“miRNA種子”來進行預(yù)測。目前，Vasudevan 等人指出，多種miRNAs不僅能抑制翻譯，而且也能增強翻譯，是抑制還是增強翻譯依賴于細(xì)胞周期所處狀態(tài)。 miRNAs在癌癥中起重要作用 miRNAs充當(dāng)基因調(diào)節(jié)器作用，能夠調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡。在許多人類腫瘤病例中，都發(fā)現(xiàn)miRNA表達異常，要么是在成熟的 miRNAs，要么是在前體miRNAs，或者二者皆有。因此，miRNAs表達水平的改變在腫瘤形成中也起重要作用。與正常組織相比，雖然在腫瘤組織中大多數(shù)miRNAs表達都下降，但是也有高表達的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。鑒于此，miRNA基因被認(rèn)為既充當(dāng)腫瘤抑制基因也充當(dāng)癌基因角色(Zhang et al., 2007)。 例如，研究發(fā)現(xiàn)肺癌病人的miRNAs let-7表達水平降低(Takamizawa et al., 2004)。在動物體內(nèi)，let-7的表達依賴于動物的生長發(fā)育周期，在發(fā)育早期let-7低表達，而分化成熟的組織let-7高表達。下調(diào)let-7的表達水平致使分化失敗，從而導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生。另外，實驗表明，RAS癌基因是miRNA let-7的直接靶點，說明在肺癌發(fā)生過程中，let-7通過調(diào)節(jié)RAS的表達發(fā)揮抑癌基因作用。第二種情況，通過作用于抗凋亡基因BCL2靶點，下調(diào) miR-15和miR-16在慢性淋巴瘤的表達。另一方面，致癌的miRNAs通過負(fù)調(diào)控抑制抑癌基因或調(diào)節(jié)細(xì)胞分化或細(xì)胞凋亡，從而促進腫瘤生長。例如，miR-17-92在許多癌癥如肺癌或淋巴瘤的表達明顯增加，它的形成可以增加肺癌細(xì)胞的生長。進一步研究表明，到目前為止，參與腫瘤形成的 miRNAs中，至少50%的miRNAs基因定位于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域(Calin et al., 2004)。 通過研究miRNAs表達譜來進行癌癥分類 基于miRNAs表達譜研究，我們可以就腫瘤發(fā)育形成和分化程度對其進行分類。較傳統(tǒng)的基于mRNA表達研究的分類方法，具有更高的精確度(Lu et al., 2005; Rosenfeld et al., 2008)。在包含多種人類癌癥的系統(tǒng)性研究中，幾乎所有的miRNAs都顯示出不同的表達，這使得將其用以鑒定不同發(fā)育起源的腫瘤成為可能。這種人類癌癥的分類方法，通過測定相關(guān)的大約200條小數(shù)量miRNAs的表達來完成，而如果通過mRNA基因表達方法的話，即使使用幾千個mRNA也不能得到同樣結(jié)果。另外研究顯示，miRNAs的表達與特異的病理學(xué)特點如腫瘤期或增殖指數(shù)具有強相關(guān)性。相比之下，由于mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾發(fā)生在從DNA轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)的過程中，因此，其表達譜常常不能直接得出生物學(xué)或者具有臨床意義的結(jié)果，而miRNAs能較為直接的反映基因功能水平。 使用miRNAs為腫瘤分類的另外一個巨大益處：將大大改善臨床研究中常規(guī)收集保存的，通過福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）組織的穩(wěn)定性。較長的mRNAs在甲醛固定和加工處理期間最可能被降解和化學(xué)修飾。而miRNAs很小，蛋白質(zhì)又受RISC絡(luò)合物的保護，故其固定方法較持久，能夠長期保持。通過廣泛的Snap Frozen Cells研究發(fā)現(xiàn)，使用FFPE樣本做miRNAs表達譜具有很高的可靠性(Li et al., 2007)。 miRNAs是診斷疾病和判斷預(yù)后的穩(wěn)定和可靠的生物標(biāo)記物 miRNAs除了顯著的組織特異性外，還具有診斷癌癥和判斷預(yù)后的作用。由于它們的基因調(diào)控靈活，將miRNAs用于癌癥治療的潛力顯而易見。所謂的抗- miRNAs寡核苷酸類物質(zhì)（AMOs），與致癌的miRNAs互補，能夠特異抑制腫瘤組織中miRNAs的活性。另一方面，起腫瘤抑制基因作用的 miRNAs的高表達可能對腫瘤的治療有益。 miRNAs不僅為癌癥，也為許多其他疾病如病毒感染性疾病、心血管疾病等提供可行的治療方案，在這些疾病治療中也涉及miRNAs的基因調(diào)控。 對miRNAs基因調(diào)控的研究是諸多研究的焦點，有關(guān)miRNAs自身基因表達調(diào)控機制的知識仍待進一步擴展。另外，miRNAs被認(rèn)為受控于漸成機制，而不是僅僅局限于自身組織和腫瘤表達模式。實際上，若干miRNAs被DNA甲基化調(diào)控。應(yīng)用去甲基化處理治療人類膀胱癌，Saito et al.發(fā)現(xiàn)大約5%的人類miRNAs的表達水平提高了至少了3倍。最顯著的效應(yīng)是miR-127，其對應(yīng)的基因嵌入CpG島。通過表觀遺傳學(xué)方法復(fù)性后，其靶基因之一卟啉-癌基因BCL6的表達是下調(diào)的，從而得出miR-127可能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。這樣，通過表觀遺傳學(xué)途徑來進行抗癌治療將變得可行。 對miRNAs表達水平高通量分析的最普遍的方法是使用寡核苷酸微陣列(Liu,C.-G. et al., 2004), 在大樣本的研究中，使用這種方法能夠同時測量成百上千miRNAs的基因表達。另外一種微陣列方法叫作微流引物延伸檢測Microfluidic Primer Extension Assay（MPEA），這種檢測方法以Febit Geniom®微陣技術(shù)的使用為基礎(chǔ)，miRNA在高度靈敏的微陣列雜交前，不需要標(biāo)記。接著，DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流動芯片的通道中，相應(yīng)的miRNA得以特異延伸。此方法將雜交檢測的特異性與酶延伸的高辨別能力相結(jié)合(Vorwerk et al., 2008)。
MPEA相對于現(xiàn)有的其它微陣列方法，顯示出突出優(yōu)勢。由于miRNA不需經(jīng)過富集、PCR擴增或標(biāo)記等預(yù)處理而直接導(dǎo)入，這樣就確保避免了實驗誤差的產(chǎn)生（見圖, A為常規(guī)雜交方法，B為微流引物延伸）。傳統(tǒng)的雜交檢測最適合鑒別雜交靶點中心位點上的錯配，相比之下，MPEA提供了更高水平的靈敏度，由于酶催化的延伸僅在3’末端幾乎完全配對時才會發(fā)生，因此很少會出現(xiàn)交叉雜交信號。與傳統(tǒng)的RNA-預(yù)處理，Klenow延伸列陣檢測（RAKE）相比，MPEA也顯示出幾點主要優(yōu)勢(Nelson et al., 2004)。RAKE微數(shù)列通過與其相應(yīng)的寡核苷酸的5' 末端結(jié)合于表面，而MPEA陣列的寡聚核苷酸捕獲探針與其3' 末端相連。MPEA的這種結(jié)合方式不僅排除了探針的自身延長，尤其重要的是說明這種延長作用遠離微通道管腔表面而沒有任何位阻。由于微流體通道的使用,也大大降低了所需RNA樣本量。MPEA具有高度的靈敏性，無需擴增，就足以檢測出來源于福爾馬林固定樣本，組織針孔吸取樣本或激光捕獲顯微分離樣本的納克級的總RNA。 |
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