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| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.pyjb.com.cn |
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microRNA(miRNA)是一類有大約22個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA在個體發育的不同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發育和分化中起有重大的調控作用。迄今為此，對miRNA的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時長、RNA的用量較大。miRNA qPCR Detection Kit采用了國際上公認的核酸檢測標準技術――Real-Time PCR技術來對miRNA進行檢測，其具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。
二：背景資料 檢測人腦組織中miRNA的表達。所選的miRNA及其擴增長度信息如下：
三：實驗內容 RNA抽提、RNA 加“PolyA”處理、RNA反轉錄、定量PCR檢測及其數據分析。 四：實驗主要儀器和試劑 主要實驗儀器:冷凍離心機、常規PCR儀、分光光度計、電泳系統 iQ5 Real Time PCR Detection System。 主要實驗試劑:TRIzol（Invitrogen）、RNA級氯仿、冷凍異丙醇及冷凍的75%乙醇、DEPC滅菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA電泳緩沖液、miRNA qPCR Detection Kit。 五：實驗操作 前期準備:為避免RNase 對RNA的降解及其提高實驗的精確性，在實驗前請準備好用DEPC處理過的離心管及其移液槍頭，同時實驗操作時，需戴口罩及其一次性手套。所有實驗操作盡可能在冰上進行Total RNA抽提。 1、樣品處理:取50mg～200mg樣品直接在液氮中研磨至粉末，再轉移一定量至含1mLTRIzol的離心管中，反復振蕩裂解組織細胞。（Note：如為貼壁細胞，去培養基后可直接加入TRIzol(5~10×107細胞數加約為1mLTRIzol)，反復吹打裂解細胞，再收集TRIzol至離心管中；如為懸浮細胞，離心收集懸浮細胞，加入TRIzol(5~10×107細胞數加約為1mLTRIzol)反復吹打裂解細胞）。 2、相分離:室溫放置上述樣品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿為200μL，蓋上蓋子，劇烈振蕩約1min，室溫靜置5min，然后12000g 冷凍離心15min（4℃），小心取出樣品，通過觀察可以發現樣品分三層，其中最上層含有RNA樣品。 3、RNA沉淀:小心吸取上清液約450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，12000g 冷凍離心10min（4℃）。 4、RNA洗滌:去上清，加入500μL 冷凍的75％乙醇，彈起沉淀后 12000g 冷凍離心5min（4℃），去上清，再稍離，吸去上清液。 5、RNA溶解:風干約5～10min（注意不能風太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水約30μL。貼上標簽后-80℃保存。 6、RNA濃度測定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀釋10倍后，在分光光度計Nanodrop上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其OD260/OD280。Note：如為常規的分光光度計，注意比色杯測定時的最少所需體積量，取一定量的RNA，用DEPC水稀釋約100倍左右，同時在紫外條件下測定OD260和OD280，再按照公式計算RNA濃度＝40ng/μL×OD260×稀釋倍數）。 7、RNA電泳檢測： 7.2 電泳緩沖液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去離子水稀釋至500mL，倒入電泳槽中。 7.3 RNA樣品處理：取RNA樣品約3μL，最后補充DEPC水至15μL，65℃變性10min后立即冷卻，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可電泳。 7.4 RNA電泳：先把RNA膠放入電泳槽中，100V作用電泳約5min，再在點樣孔中點入處理過的RNA樣品，100V左右電泳至溴酚藍至膠的1/3處，取膠拍照。 8、RNA抽提結果: 8.2 RNA電泳的各泳道所對應的樣品及其樣品濃度和OD 260/OD280。
9、miRNA 3’端進行加“Poly A”處理
在反應中使用的total RNA必須含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng～10μg之間調整，如使用純化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之間調整。 10、PolyA反應： 混勻配制的反應mix，短暫離心后在37℃反應15min。所得的反應液可以直接進行下游實驗，也可以放置-20℃短暫保存，如需長期保存建議存放于-80℃。 11、Poly A化的RNA進行反轉錄反應： 融解反轉錄反應所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反應：
混勻RNA-Primer Mix，短暫離心，直接65℃變性10min后立即放置冰上至少2min。
配制反轉錄反應液：
在RNA-Primer Mix反應管內加入以下試劑至總體積25μL。
反轉錄反應: 12、qPCR 檢測miRNA. miRNA檢測引物設計：miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA檢測的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 檢測引物需客戶參考miRNA序列自行設計或直接從我公司定購以驗證的引物。因為miRNA序列長度一般都在18～24nt之間，所以其檢測的 Forward 檢測引物一般都直接選用其miRNA序列或為增加其檢測的特異性而特殊設計的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚體，其引物可為miRNA 3’端去除幾個堿基后整理的序列。 miRNA qPCR Forward Primer 設計舉例（以小鼠mmu-miR-125b-5p為例）： 則其Forward 檢測引物可為：
融解2×qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。冰上進行qPCR反應液的配制（所有miRNA進行復孔測試，同時進行單孔NTC（No template control）測試）
1）2×qPCR Mix設定為總反應體積的一半，其它組分請按最適比例進行調整。如需變更總反應體積，請保持最適條件下各組分的比例。
2）Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR儀，如ABI的定量PCR儀。 3）引物終濃度可在0.2μM～0.4μM范圍內調整，一般條件下0.2μM的量即可達到理想的效果。 4）1st Strand cDNA 通常需要稀釋后再使用 ，防止反轉錄體系對qPCR體系的影響。 5）充分混勻qPCR反應液，添加至PCR反應管中，短暫離心，確保所有試劑到反應管底部。 6）qPCR 反應，使用標準的三步法進行檢測（以Bio-Rad 的iQ5進行實驗的設計）。
對于用SYBR Green 染料法進行的qPCR的檢測的反應都需要在循環結束后立即進行融解曲線分析（以Bio-Rad 的iQ5進行實驗的設計）
1）、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶為經過特殊修飾的熱啟動酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2）、因miRNA的特殊性從而導致了其引物的特殊性，在檢測時應嚴格控制退火溫度，防止出現非特異性擴增。 3）、進行反轉錄的Oligo dT Adaptor其長度為53nt，為此PCR擴增得到的片段長度一般在75bp左右（miRNA序列一般為22nt左右），所以延伸只需10sec即可。對產物的融解曲線判斷可以發現其Tm值一般都在79℃～83℃范圍內，如果超出此范圍，建議使用別的方法來驗證產物的特異性（如電泳）。 以上的反應條件主要參考的為Bio-Rad 的iQ5定量PCR儀器，如使用的為不同公司的定量PCR儀，請按照不同的儀器要求，調整延伸時間及其融解曲線分析的條件。
六:結果分析 20個miRNA及其內參U6的擴增曲線及其融解曲線結果 20個miRNA及其內參U6的電泳結果圖及其檢測原始平均Ct值
原文地址：MIRNA(microRNA)檢測實驗流程(加polyA法)作者：阮阮
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