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污染的類型 細胞培養過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養環境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質，包括生物和化學物質。 一、細菌污染 細菌污染是實驗室細胞培養中常見的污染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素(一般為預防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養細胞受細菌污染后，會出現培養液變混濁，pH改變。也有的培養液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發現菌體才知污染。所以，每天應仔細觀察。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。 二、真菌污染 真菌污染是細胞培養過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節進行細胞培養更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培養細胞受真菌污染后，可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養液一般不發生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。 三、支原體污染 支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結構，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。 培養細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。 四、病毒污染 采用組織細胞培養法生產疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養物，會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞和會發生變異、轉化，形成異倍體的細胞系。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。 五、非同種細胞污染 由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發現猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現在句卻認為是HeLa細胞。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。 非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生，大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。 污染來源及鑒別 一、污染來源 細胞培養過程中污染的來源主要有以下幾條途徑： 1、不潔的動物組織標本 很多動物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統除外)，但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細菌，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌，造成細胞污染。 2、空氣 空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時不帶口罩或外界氣流過強，污染空氣進入操作區，也會導致污染。春夏季南方地區多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。 3、清洗消毒 培養用物品、材料洗刷不凈，培養用液和器材滅菌不徹底也會引入微生物和有毒物質。 4、操作 來自操作者的污染主要有以下幾方面： (1)器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過，或者是否已經消毒滅菌處理過，或者雖經處理，時隔已久又末重新處理。 (2)操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細菌和支原體。 (3)培養瓶口未用75%酒精擦和燒灼。 (4)操作者不當心，動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。 (5)操作者操作時大聲說話，來回走動揚起灰塵等。 5、血清 市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。 二、污染的鑒別 1、細菌、真菌污染的檢測 (1)肉眼觀察 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到。如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。 (2)鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。 (3)接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。 2、支原體污染的檢測 (1)相差顯微鏡觀察 將細胞接種于事先放置于培養瓶內的支持物(一般用長形蓋玻片)，24小時后用清潔塵鑷子從培養瓶中取出支持物，細胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察;若不用支持物培養法，直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。 (2)低漲處理地衣紅染色觀察 取已在培養瓶中的支持物蓋片或培養液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養液時，先吸取1mL，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片。然后用2%醋酸依地紅(地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL)染5分鐘。純酒精過三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中。若染色過深，可先用75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見支原體呈暗紫色小點，位于細胞外或細胞之間。 (3)熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養法將細胞接種在蓋片上，在細胞匯合前(即未長滿前)取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細胞面滴加數滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細胞培養液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。 (4)電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行。需經過固定、包埋、切片后才能進行觀察。詳細方法同細胞形態觀察法(見第九章)。 (5)培養檢測 將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基(Sigma或北京生物制品所生產的均可)，培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。 污染的清除和預防 一、污染的清除 培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之;有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。 1、使用抗生素 抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative, BM-Cyclin2:BM-1和四環素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存備用，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養液，加入含BM-1的RPMI1640培養液，3天后再吸除培養液，加入含BM-2的RPMI1640培養液，培養4天，如此連續3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養液培養傳代3-4次。 2、加溫處理 將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細胞影響最小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。 3、使用支原體特異性血清 用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。 4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，還有動物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養。 二、污染的預防 預防是防止細胞培養過程中發生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到最小程度。一般預防可從以下幾方面著手： 1、從物品、用品消毒滅菌著手 細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。 2、從操作者做起 (1)操作者責任心要強，要細心穩重，操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規定穿隔離衣。進入后關好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養物，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大批污染。 (2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。 (3)操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。 3、防止細胞交叉污染 在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發生混亂。 在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。 所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應及早留種凍存，一旦發生污染可棄之復蘇，重新培養。 lonza 無血清 培養基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html |
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