白玉杰綜述 藥立波審校
(第四軍醫大學生物化學及分子生物學教研室， 西安710032)
蛋白質是生命功能的物質基礎， 體內包括復制、轉錄、分泌、信號轉導、代謝等多種生命活動都依賴于蛋白-蛋白、蛋白-核酸間的相互作用， 對生命活動過程中蛋白質作用的研究有助于揭示生命過程的許多本質問題。但由于蛋白質與其他生物大分子間作用依賴于細胞內環境， 作用時間及作用力差異極大， 因而傳統生化方法受到較大限制， 蛋白-蛋白及蛋白-核酸間作用的研究進展緩慢。新興起的雙雜交系統應用有效的酵母遺傳學方法分析蛋白間相互作用， 能快速克隆編碼與某一蛋白作用的配體蛋白的基因， 得到廣泛應用， 在此基礎上相繼出現反向雙雜交系統、三雜交系統等多種新技術， 大大加速了此領域的研究。
一、酵母雙雜交系統
(一) 基本原理
酵母雙雜交系統由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立 i 。典型的真核生長轉錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域: DNA結合結構域(DNA-binding domain)和轉錄激活結構域(transcription-activating domain)。前者可識別DNA上的特異序列， 并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游， 轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用， 啟動它所調節的基因的轉錄。二個結構域不但可在其連接區適當部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發揮轉錄激活作用。酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構建融合基因時， 測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達， 其表達產物只有定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli轉錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。
雙雜交系統的另一個重要的元件是報道株。報道株指經改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統具有許多優點: 〈1〉 易于轉化、便于回收擴增質粒。〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。〈3〉酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA－結合結構域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個基因融合到轉錄激活結構域(如GAL4-ad， VP16)。激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中， 蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)， 從而可分析蛋白間的結合作用。
酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物而增強， 后者又與啟動子DNA結合， 此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩定。④通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大。 同時， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。
(二) 酵母雙雜交系統的應用
1特點與優點
酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點: ⑴ 作用信號是在融合基因表達后， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細胞內進行， 可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷ 酵母雙雜交系統可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。
2結構組成
酵母雙雜交系統可應用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結構域。利用此系統已分析和測定了多種重要結構域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結構域v， p21cip1蛋白與增殖細胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的結合序列vi等。
此外酵母雙雜交系統還應用于闡明蛋白質相互作用的結構域，繪制蛋白質聯系圖譜，在藥物設計等許多方面。
(三) 酵母雙雜交系統局限性和存在的問題
酵母雙雜交系統是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應用， 但仍存在一些局限性。⑴ 雙雜交系統分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內， 而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內無法進行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。⑵ 酵母雙雜交系統的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發揮轉錄激活作用， 使DNA結合結構域雜交蛋白在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質的低親和力區域， 能與其他蛋白形成穩定的復合物， 從而引起報告基因的表達， 產生"假陽性"結果。
許多研究者對雙雜交系統進行了改進和發展，。例如采用假陽性顯示分析法和雙篩選系統以減少"假陽性"的發生；發展哺乳動物雙雜交系統更好地研究蛋白將的相互作用。其中雙篩選系統用二種不同的報告基因(常用lacZ和HIS3)有以下優勢vii:⑴ 用不同的啟動子表達位于酵母二個染色體上的報告基因， 可明顯減少假陽性。⑵ 通過營養型篩選增強了篩選能力， 尤其適用于對較大的庫容量而被選蛋白較少情況下的篩選。
哺乳動物雙雜交系統viii也是一種基因水平上以重建轉錄因子功能為基礎的體內分析方法。在此系統中，一種感性趣的蛋白與Gal4--DNA結合結構域構成融合蛋白，另一種蛋白與單純皰疹病毒VP16蛋白的激活結構域以融合蛋白表達。表達這些融合蛋白的載體與一個報道載體（CAT）共同轉染哺乳動物細胞系。報道質粒含一個Gal4結合位點下游的cat基因。假如兩個融合蛋白相互作用則cat報道基因表達水平明顯增高。用此系統證實了P53蛋白與大T抗原的相互作用， 得到了酵母雙雜交系統相同的結果。且較酵母雙雜交系統更為快速，在轉染48h內得到結果。并且在哺乳動物細胞能更好模仿體內的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳動物雙雜交系統可作為酵母雙雜交系統的輔助手段
二、反向酵母雙雜交系統
確定了蛋白之間的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、結構及其作用的條件調節。鑒定在相互作用的一對蛋白中的任一蛋白突變對其相互作用的抑制作用， 不僅有助于探索相互作用的結構單位， 而且可作為研究體內功能的遺傳學方法。這對于多個作用分子的蛋白就更為重要。
1996年Vidalix x等建立了反向酵母雙雜交系統(reverse two-hybrid system)， 提供了簡便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。反向酵母雙雜交系統的關鍵是摻入一種表達產物對細胞生長有毒的報導基因， 用于監測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達產物是尿嘧啶合成所必需的， 同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉化為有毒物質。Vidal等構建了一酵母細胞株， 其URA3的表達由含GAL4結合位點的啟動子嚴密控制。此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養基中培育需要GAL4激活結構域(GAD)和GAL4 DNA結合結構域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表達。而在含5-FOA的完全培養基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機突變庫中鑒定阻斷蛋白相互作用的突變體。
反向雙雜交系統可更有效地蛋白間作用的關鍵位點或起決定作用的個別氨基酸， 進而分析蛋白結構和功能的關系。此外此系統還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質用作臨床治療制劑。
三、酵母三雙雜交系統
三雜交系統(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA間的相互作用。Senguptaxi等首先報道了應用三雜技系統分析金屬調節蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)與金屬反應元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV轉錄激活蛋白(trans-activator protein， Tat)與HIV轉錄激活反應元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列間的作用。
三雜交系統的基本原理是將一個已知的RNA結合蛋白與轉錄因子的DNA結合domain(如LexA)構建第一個融合蛋白，第二種蛋白(待選的RNA結合蛋白)與轉錄激活結構域構建融合蛋白。此外構建和表達一雜合RNA，含有二個不同的結合位點。當RNA與二個RNA結合蛋白的結合位點相互作用時可激活報道基因的轉錄和表達。如Dhruba等在IRP1與IRE的RNA相互作用的研究中，第一個RNA結合蛋白選用噬菌體MS2被殼蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可識別RNA中的21nt的莖環序列，并與之有較高的親和力。將其與LexA融合構建雜合蛋白。IRP1與Gal4的激活結構域(activation domain)融合構建另一個雜合蛋白。IRE mRNA在非編碼區有21nt的莖環區序列，編碼區編碼與IRP1特異性結合的蛋白序列。在實驗中他們用一質粒表達雜交RNA，含2個MS2 coat protein結合位點和1個IRE。
三雜交系統提供了快速、多用的體內檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。與雙雜交系統相比，雜交RNA與雜交蛋白有些不同：首先，雜交RNA分子可能不是生理結構，雜交的不同RNA組分對正常結構會有一定影響。但Dhruba的研究表明，局部、相對穩定的結構區如MS2 coat protein，IRP1識別位點等可在體內共存于同一雜交RNA分子中。其次，這些RNA中的莖環區結構相當穩定，RNA只要形成部分正確結構，則足以介導轉錄激活作用。
象雙雜交系統一樣，三雜交系統具有廣泛的應用。〈1〉應用此系統可分析確定RNA--蛋白作用的精確結構域，甚至單個核苷酸或氨基酸殘基。〈2〉用于鑒定和克隆識別結合有重要生理功能RNA(如轉錄、定位、RNA病毒包裝和感染等)的蛋白質，可用于調控的機理研究、疾病的防治以及抗病毒藥物的研制開發。〈3〉通過構建雜交RNA庫，可篩選與特定蛋白結合的RNA。〈4〉有可能在此基礎上發展四雜交系統研究RNA-RNA間的相互作用。
參考文獻
1.Fields， S. and Song， O-K. Nature 1989；340： 245-246
2.Hardy，E.， Sussel， L. and Shore， D. Gene Dev. 1992; 6: 801-814
3.Harper， J. W. et al. Cell 1993; 75: 805-816
4.Serrano， M. ， Hannon， G. J. and Beach， D. Nature 1993; 366: 704-707
5.Holt， K. H. ， Olson， A.L. et al. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 42-49
6.Warbrick， E.， Lane， D. P.， et al. Curr. Biol. 1995; 5: 275-282
7.Finley， R. L. and Brent， R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 12980-12984
8.Y. Luo， Batalao， A. and H. Zhou Biotechniques 1997; 22(2): 350-352
9.Vidal， M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 10315-10320
10.Vidal， M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 10321-10326
11.Sengupta， D. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 8496-8501
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